转移因子对猪淋巴细胞E玫瑰花结百分率影响的测试研究

徐 磊 薛 萍 林祚贵 刘俊斌 谭礼宁 刘小龙王晓斌 叶盛聪 杨 慧 黄 瑜 朱国强＊

（1.福建农业职业技术学院 福州 350119；2.扬州大学兽医学院 江苏扬州 225009；3.派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500；4.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013）

转移因子（Transfer Factor，TF）是白细胞内可透析、具有生物活性的非均一小分子混合物，是一种细胞因子。其成分复杂，主要含有多肽和核糖，以及多种游离氨基酸和 Na、Mg、K、Ca、Zn 等金属元素[1-6]。TF是具有特异和非特异性免疫活性的细胞调节因子，可特异或非特异的调节机体免疫状态，增强机体免疫水平，是一种新型、有效、安全的免疫调节制剂[7-10]。

试验按照本课题组已获授权国家发明专利制备TF[11-13]，通过肌肉注射TF研究其对猪淋巴细胞E玫瑰花结百分率的影响，揭示TF发挥免疫增强作用的一些机理，为兽用TF的临床应用提供相关试验参考。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂 磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、葡萄糖、碳酸氢钠、枸橼酸、枸橼酸钠、姬姆萨染料和台盼蓝均购自国药集团化学试剂有限公司；戊二醛、甘油和甲醇均购自西陇化工股份有限公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；光学显微镜为日本Nikon公司产品，型号ECLIPSE E100。

1.2 试验动物 同窝健康检验用仔猪12头，均于20日龄断乳，断乳后于全排风正压恒温恒湿检验猪舍隔离饲养，25日龄时随机分为2组，分别为：试验组和对照组，隔离饲养，每组各6头猪。

1.3 TF制备 按照本课题组已获授权的国家发明专利制备TF[11-13]：以健康猪脾脏为原料，经匀浆、细胞破碎、灭活、微滤、超滤后精制而成。经检验，所制备TF的pH值为7.1，多肽含量为3.2 mg/mL，核糖含量为92.0 μg/mL，脱E受体法效力检验活力为16%，细菌内毒素含量小于10 EU/mL，在251 nm波长处有最大吸收峰，OD260nm/OD280nm比值为2.22，蛋白质定性检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、热原检验、异常毒性检查、过敏反应检查、安全检验均合格。

1.4 试验设计 同窝健康检验用仔猪25日龄时，试验组注射TF，对照组注射生理盐水，各组注射剂量均为2.0 mL/头。分别于注射前第3 d及注射后第3 d、7 d、14 d、21 d 采集外周血，阿氏液抗凝，用于检测仔猪外周血淋巴细胞E玫瑰花结百分率。所得数据用单因素方差分析和最小显著性差法（LSD）分析，P＜0.05为差异显著。

1.5 猪外周血淋巴细胞E玫瑰花结百分率的测定

1.5.1 试剂配制

1.5.1.1 Hank's液 将0.3%磷酸二氢钾溶液、0.76%磷酸氢二钠溶液、2%氯化钾溶液及20%氯化钠溶液依次按20 20 20 40比例混合，加葡萄糖1.0 g，溶解混匀，用水稀释至1 000 mL，并用4%碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2～7.3（临用时配制）。

1.5.1.2 阿氏液 取氯化钠0.420 g、枸橼酸0.055 g、枸橼酸钠0.766 g、葡萄糖 2.05 g，加水溶解并稀释至100 mL，灭菌。

1.5.1.3 分离液 为淋巴细胞分离液。

1.5.1.4 羊血 取绵羊静脉血5.0 mL，加入5.0 mL阿氏液中，冰箱保存。

1.5.1.5 固定液 取25%戊二醛溶液、3.5%碳酸氢钠溶液及Hank's液依次按1 1 38比例混合。

1.5.1.6 姬姆萨染色液原液 取姬姆萨染料0.5 g，加甘油33 mL，55～60℃加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温，加入33 mL甲醇，室温放置24 h后用滤纸过滤，滤液即为原液。密封室温保存。

1.5.1.7 染色液 取姬姆萨染色液原液2.0 mL，加Hank's液6.0 mL，摇匀，以1 500 r/min离心10 min，取上清液待用。

1.5.1.8 0.5%台盼蓝溶液 1%台盼蓝溶液与1.7%NaCl等体积混合，用滤纸过滤。

1.5.2 淋巴细胞E玫瑰花结百分率测定的操作法

1.5.2.1 猪淋巴细胞悬液制备 取猪抗凝血，加等量Hank's液稀释成细胞悬液后轻轻加入到已含有等量分离液的离心管中。以2 000 r/min离心20 min，小心吸出中间层的淋巴细胞，放入另一离心管中，加适量Hank's液洗涤，摇匀，以1 500 r/min离心3～5 min，弃去上清，再洗涤一次后用Hank's液适当稀释，用台盼蓝染色并计数活细胞数(＞95%)，使最终淋巴细胞浓度为（3×106）～（5×106）个/mL。

1.5.2.2 绵羊红血球悬液的制备 取适量羊血，用适量Hank's液洗三次（同前）。弃去上清液，加适量Hank's液稀释并计数，使最终浓度为猪淋巴细胞悬液浓度的8～10倍。

1.5.2.3 测定 每支小试管均加入猪淋巴细胞悬液0.2 mL，再分别加入绵羊红细胞悬液0.2 mL，混匀，37℃水浴5 min，500 r/min离心3 min，置4℃冰箱过夜。次日取出，弃去上清液，每管中各加入固定液1滴，轻轻摇匀，静置10 min，加入染色液2滴并摇匀，静置15 min后开始计数，显微镜视野中淡蓝色、较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板64个大方格上所有淋巴细胞的个数 (不少于200个)，统计其中E玫瑰花结形成的细胞数 (结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)，求得E玫瑰花结百分率。

2 结 果

结果显示，注射TF后，试验组仔猪外周血淋巴细胞E玫瑰花结百分率明显提高，于注射TF后第7 d达到峰值（54.3%）；而对照组仔猪外周血淋巴细胞E玫瑰花结百分率较稳定，维持在31.2%左右，见表1。

试验组仔猪外周血淋巴细胞E玫瑰花结百分率，于注射TF后第3 d、7 d及14 d均显著高于对照组（P＜0.05），分别比对照组提高了 14.6%、22.0%和 14.9%，见图 1-图2。

结果表明，TF能显著提高猪外周血淋巴细胞E玫瑰花结百分率。

3 讨 论

1949年，Lawrence首次发现结核菌素阳性供体的活淋巴细胞能使皮试阴性受体转变为皮试阳性。1953-1955年，Lawrence等将结核菌素阳性供体的白细胞可透析物质 （Dialyzable Leukocyte Extract，DLE）重复试验后，发现DLE具备活淋巴细胞同样的功能，即DLE仍具有转移迟发型变态反应的作用，并把能引起这种效应的物质称为 “转移因子”[1-3]。

表1 E玫瑰花结百分率结果

图1 对照组E玫瑰花结形成图例

图2 试验组E玫瑰花结形成图例

自20世纪50年代发现TF至今，国内外许多学者对TF的制备方法、理化特性、生物学特性、免疫特性、热原性、毒性及安全性进行了广泛、深入的研究，发现TF具有分子质量小、无毒、无抗原性、不引起过敏反应，不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点，并且在TF治疗免疫缺陷、恶性肿瘤、各种感染性疾病等方面进行了治疗试验研究，均取得一定的疗效。1979年以后，逐渐将TF应用于兽医免疫和临床治疗，在动物疾病防控中发挥了一定作用[7-17]。

淋巴细胞是机体最主要的免疫活性细胞，其中T细胞介导细胞免疫。淋巴细胞E玫瑰花结百分率可以反映机体的细胞免疫水平，可作为机体免疫功能的测试指标之一[18-19]。TF可非特异性地增强细胞免疫，进而提高机体免疫功能[7-10]。不同工艺方法制备的TF所含组分差异不大，但各组分的含量和制品效力会有较大差异[11-17]。国内有学者在制备猪脾犬瘟热五联疫苗特异性TF时，发现特异性TF在小鼠E玫瑰花环形成率及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性方面具有显著的增强效果[20]。在本试验中，按本发明专利所制备的TF对猪淋巴细胞E玫瑰花结百分率的影响结果显示，试验组仔猪外周血淋巴细胞E玫瑰花结百分率，于注射TF后第3 d、7 d及14 d均显著高于对照组（P<0.05），分别比对照组提高了14.6%、22.0%和14.9%。结果表明，本发明专利所制备的TF具有显著提高猪免疫功能的作用。

试验按本课题组已获授权国家发明专利制备TF[11-13]，通过肌肉注射研究TF对猪淋巴细胞E玫瑰花结百分率的影响，结果显示TF可显著提高猪外周血淋巴细胞E玫瑰花结百分率和猪免疫功能。