番鸭呼肠孤病毒感染对MPV-GPV弱毒疫苗抗体应答的影响

林锋强 朱小丽 陈仕龙 肖世峰 程晓霞 王 劭 陈少莺

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013）

番鸭呼肠孤病毒病临床上以软脚为主要症状，以肝、脾表面有多量白点、肾脏肿大、出血、表面有黄色条斑为主要病理变化的传染病[1-2]。该病在意大利、美国、德国和以色列等国家传播，国内福建、广东和浙江等省份自1997年以来都有该病发生的报道，通过血清学调查表明在番鸭群中广泛存在呼肠孤病毒感染，给番鸭养殖业带了巨大的经济损失[3-5]。

番鸭呼肠孤病毒为免疫抑制性病毒，能够感染番鸭、半番鸭和鹅等水禽[6]，感染后引起水禽免疫器官坏死或萎缩等病变，对免疫功能有抑制作用。番鸭养殖过程中番鸭细小病毒（MPV）病和番鸭小鹅瘟病（GPV）是危害最大的传染性疾病，造成巨大的经济损失[7-8]。我们研制的番鸭MPV-GPV二联弱毒疫苗是目前预防这两种疫病的主要手段，免疫保护率可达90%以上[9]。为了探讨番鸭呼肠孤病毒感染对MPV-GPV二联弱毒疫苗免疫造成的影响，本研究从番鸭呼肠孤病毒感染对MPV-GPV二联弱毒疫苗抗体应答和番鸭B淋巴细胞增殖反应的变化出发，探讨MDRV感染对番鸭体液免疫应答的影响，为有效防治该病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株和疫苗 番鸭呼肠孤病毒（MDRV MW9710株）由本室分离、鉴定并保存。MPV-GPV二联弱毒疫苗由本实验室制备（批号20170520）。

1.2 试验动物 1日龄雏番鸭购自莆田广东温氏家禽有限公司，雏鸭未免疫任何疫苗。

1.3 主要仪器及试剂 RPMI-1640购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；LPS购自sigma公司，用RPMI-1640配成1 mg/mL，冷冻保存备用。MTT购自sigma公司，用RPMI-1640配成5 mg/mL，冷冻保存备用。淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自上海化学试剂研究所；ELX800UV酶标仪为Bio-tek产品。

1.4 试验分组及设计 100羽番鸭分为对照组（50羽）、MDRV(1 200，50羽）。1日龄时对照组注射0.2 mL Hank's；MDRV组感染量按1 200稀释病毒原液后腿肌注射0.2 mL/羽（103.8TCID50/羽）。攻毒后隔离饲养。

1.5 病毒感染对MPV-GPV弱毒疫苗诱发抗体反应的影响 取对照组和MDRV组各10羽，于1日龄时腿肌免疫MPV-GPV弱毒疫苗1羽份/羽，于免疫后 7 d、14 d、21 d、28 d 采血分离血清，用 LPAI法检测抗MPV和GPV抗体，比较试验组与对照组之间的差异。

1.6 淋巴细胞分离

1.6.1 番鸭外周血淋巴细胞分离 感染后第7 d、14 d、21 d和28 d将无菌心脏采集番鸭抗凝全血叠加于等量的淋巴细胞分离液上；3 000 r/min离心10 min，吸取淋巴细胞层，移入无菌离心管中；加入适量Hank's液，离心10 min，弃上清，重复洗涤3次；加入2 mL淋巴细胞培养液悬浮细胞；6 g/L台酚蓝染色计数，用淋巴细胞培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。

1.6.2 脾脏和法氏囊淋巴细胞分离 感染后第7 d、14 d、21 d和28 d将无菌采集的脾脏和法氏囊分别放入已盛有Hank's液的平皿中，用灭菌剪刀、镊子剥去被膜；剪碎后，移入灭菌50 mL离心管中；加入4 mL胰酶，轻轻晃动离心管，使组织和胰酶充分混匀，37℃水浴作用30 min，每隔10 min摇匀一次；消化完毕之后，过平皿中的200目筛网，分别收集组织细胞悬液，3 000 r/min，离心10 min；弃上清，加入红细胞裂解液3 mL，重悬沉淀细胞，冰浴作用30 min，待红细胞完全破碎后，3 000 r/min离心10 min，弃上清；Hank's液洗3次，加入2 mL淋巴细胞培养液重悬细胞，台酚蓝染色计数，调整细胞浓度为 5×106个/mL。

1.7 淋巴细胞增殖反应 试验孔每孔加50 μL细胞悬液和 50 μL 20 μg/mL ConA， 对照孔加 50 μL细胞悬液和50 μL RMPI 1640完全培养基，均设3个重复，并设RMPI 1640空白孔。40℃、5%CO2培养60 h。培养结束前3 h，各孔加入10 μL MTT。培养结束后2 000 r/min离心10 min，倾去上清液，加入150 μL DMSO溶液反应20 min，酶标仪检测各孔OD570nm值。用刺激指数（SI）评价组间差异性。SI计算方法：

1.8 数据统计分析 使用Microsoft Excel软件进行标准差和方差分析，不同组别的所有数据用t检验确定差异显著性。

2 结 果

2.1 MDRV感染对番鸭GPV抗体应答的影响由图1可以看出：1日龄番鸭免疫MPV-GPV二联疫苗后，IM 7 d时所有番鸭GPV-LPAI效价均为阳性，达3log2以上。随后持续上升，到IM 21 d后效价可达6log2以上，可持续到IM 28 d。 而1日龄番鸭感染MDRV后免疫MPV-GPV二联疫苗，IM 7 d时番鸭GPV-LPAI效价平均值1.5log2；随后缓慢上升，到IM 21-28 d时GPV-LPAI效价平均值维持在约3log2。与单独免疫组相比，GPV-LPAI效价大大降低，不能提供有效保护。说明MDRV感染严重干扰了番鸭小鹅瘟疫苗的抗体免疫应答，使番鸭对番鸭小鹅瘟病毒的易感性增强。

图1 MDRV感染对番鸭GPV抗体免疫应答的影响

2.2 MDRV感染对番鸭MPV抗体应答的影响由图2可以看出：1日龄番鸭免疫MPV-GPV二联疫苗后，IM 7 d时所有番鸭GPV-LPAI效价均为阳性，达3log2以上。随后持续上升，到IM 21 d后效价可达6log2以上，可持续到IM 28 d。而1日龄番鸭感染MDRV后免疫MPV-GPV二联疫苗，IM 7 d时番鸭GPV-LPAI效价平均值1.5log2；随后缓慢上升，到IM 21-28 d时GPV-LPAI效价平均值维持在约3log2。与单独免疫组相比，GPV-LPAI效价大大降低，不能提供有效保护。说明MDRV感染严重干扰了番鸭MPV的抗体免疫应答，使番鸭对番鸭MPV的易感性增强。

图2 MDRV感染对番鸭MPV抗体应答的影响

2.3 番鸭外周血液B淋巴细胞增殖功能的变化1日龄番鸭人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴细胞增殖指数与对照组相比，差异显著（P<0.05）。PI 14-28 d与对照组相比差异极显著（P<0.01）。表明MDRV感染抑制了外周血B淋巴细胞增殖功能。

表1 番鸭外周血B淋巴细胞增殖功能的变化（x±s，n=5）

2.4 番鸭法氏囊B淋巴细胞增殖功能的变化1日龄番鸭人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴细胞增殖指数与对照组相比，差异显著（P<0.05）。PI 14-28 d与对照组相比差异极显著（P<0.01）。表明MDRV感染抑制了法氏囊B淋巴细胞增殖功能。

表2 番鸭胸腺B细胞增殖功能的变化（x±s，n=5）

2.5 番鸭脾脏B淋巴细胞增殖功能的变化 1日龄番鸭人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴细胞增殖指数与对照组相比，差异显著（P<0.05）。PI 14-28 d与对照组相比差异极显著 （P<0.01）。表明MDRV感染抑制了脾脏B淋巴细胞增殖功能。

表3 番鸭脾脏B淋巴细胞增殖功能的变化（x±s，n=5）

3 讨 论

体液免疫应答由B细胞介导，B细胞分化过程可分为2个阶段，即抗原非依赖期和抗原依赖期。在抗原非依赖期，B细胞分化与抗原刺激无关，主要在中枢免疫器官内进行，法氏囊是禽类体液免疫中枢器官，是产生成熟B淋巴细胞的基础；而抗原依赖期是指成熟B细胞受抗原刺激后，继续分化为合成和分泌抗体的浆细胞阶段，这个阶段主要在外周免疫器官内进行包括了对抗原的识别、活化、增殖等过程[10]。法氏囊和脾脏损伤、B淋巴细胞数量减少及其增殖功能降低，严重影响了机体的体液免疫应答和免疫机能[11-12]。

近年来流行病学调查表明MDRV在我国番鸭饲养过程中普遍存在，番鸭常发生其他细菌或病毒的继发感染或并发感染，产生的原因是番鸭呼肠孤病毒导致番鸭免疫功能下降[13-14]。王全溪等研究发现，MDRV感染脾浆细胞数量、淋巴细胞在感染过程中明显减少，导致机体的细胞免疫和体液免疫受到严重破坏[15]。陈志胜等研究表明雏番鸭呼肠孤病毒对雏鸭免疫器官的细胞凋亡具有诱导作用。揭示该病毒致病机理与淋巴细胞凋亡从而引起的免疫抑制相关[16]。卢玉葵等检测免疫组织TANAE+、浆细胞，细胞数量的变化发现感染MDRV后番鸭免疫器官T细胞、浆细胞明显减少[17]。

本研究认为番鸭呼肠孤病毒感染严重干扰了番鸭MPV-GPV二联弱毒疫苗的抗体应答，使番鸭在易感日龄抗体效价大大降低，处于易感状态。MDRV感染导致MDGPV活疫苗免疫抗体效价不合格 （判定标准为14日龄免疫番鸭MDGPV LPAI抗体效价大于3log2），造成免疫失败。可能的原因是由于MDRV感染抑制IL-2和IFN-γ等细胞因子生成，使B细胞增殖和分泌抗体能力减弱，抗体免疫应答水平下降，导致番鸭对MDGPV感染更加易感，危害性大大加强。MDRV感染后外周血B淋巴细胞增殖能力下降，抑制IL-2和IFN-γ生成。从细胞因子免疫调节功能来看，IL-2能够促进B细胞增殖和分泌抗体，IFN-γ能够促进B细胞增殖分化。这两种细胞因子抑制生成与导致体液免疫应答水平显著下降有一定的相关性。

因此，建议临床上要重视对番鸭呼肠孤病毒病的免疫，降低因MDRV免疫抑制导致的其他病毒感染（如番鸭三周病或小鹅瘟等）的危害性增强，减少经济损失。