二代测序技术在儿童T淋巴母细胞淋巴瘤全外显子测序中的应用

姚新原，温贤浩，宪 莹，朱 进，肖剑文，3

1重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤中心；2儿童发育疾病研究教育部重点实验室；3儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014

T细胞性淋巴母细胞淋巴瘤（T-LBL）和T细胞性急性淋巴细胞白血病（T-ALL）均是起源于不成熟前体T淋巴细胞的恶性肿瘤，一般以骨髓原始及幼稚淋巴细胞≥25%诊断T-ALL，而＜25%或骨髓未受累诊断T-LBL[1]。各种理化、遗传因素引发的DNA损伤所导致的体细胞突变是T-LBL发病的重要因素及肿瘤细胞的特异性标记，文献报道体细胞突变的肿瘤标记（如NOTCH1、FBXW7等）与T-ALL及T-LBL预后相关[2-3]。既往多采用PCR扩增后一代测序（Sanger测序）技术检测肿瘤基因突变，但检测到的基因突变种类且灵敏度不高[2]。全外显子组是致病突变最为集中的区域，因此在T-LBL患儿样本中开展全外显子测序（WES）检测肿瘤细胞存在的基因突变，可以一次性检测到目前全部已知的肿瘤基因突变，也可用于定期随访其治疗后特异性肿瘤基因突变水平和残留病灶监测[4]，对于T-LBL治疗具有重大指导意义。但如果采用常规的Sanger测序技术进行WES测序费用高且耗时长，根本不能应用于临床诊疗。二代测序技术（NGS）大幅度提高了外显子组测序的速度和测序量而检测费用显著降低，使得肿瘤患者组织标本的常规WES检测成为可能[5]。

T-ALL患儿可采集骨髓标本提取基因组DNA进行NGS测序检查，而T-LBL病理标本多采用福尔马林固定后石蜡包埋保存，故难以获得新鲜肿瘤组织提取基因组DNA进行NGS检测，尤其是已经保存较长时间的样本基因组DNA存在不同程度的降解，更是增加了检测难度。本研究从10例T-LBL患儿石蜡包埋组织切片中提取基因组DNA，进行基于NGS技术的全外显子组测序并用于探索T-LBL患儿的体细胞突变，为进一步研究应用WES测序检测肿瘤基因突变打下基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入2013年3月～2017年6月在重庆医科大学附属儿童医院血液科住院治疗的10例T-LBL患儿作为研究对象，其中男性6例，女性4例，年龄82.70±12.27月。10例患儿均行淋巴结活检确诊。纳入标准：（1）诊断时年龄均＜18岁；（2）按照WHO-2008造血及淋巴组织肿瘤诊断标准完善检查且符合T-LBL诊断[6]。排除标准：（1）骨髓原始及幼稚淋巴细胞比例≥25%；（2）既往接受过抗肿瘤治疗：（3）继发性肿瘤患儿。所有淋巴结活检标本均经过福尔马林固定后石蜡包埋、室温存放。

1.2 方法

1.2.1 石蜡包埋组织处理 每例石腊固定标本均连续切片5～10张，厚度为5 μm。二甲苯脱蜡2次（40 ℃水浴，时间12～24 h）后无水乙醇漂洗2次，离心5 min去上清液并真空干燥。加入1000 µg/mL蛋白酶K细胞裂解液（50 ℃水浴，12～24 h）处理后收集细胞，PBS洗涤并离心，300目尼龙网过滤后收集细胞悬液。

上述步骤所得细胞悬液利用基因组DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood MiniKit，Qiagen）提取样本DNA，方法参考试剂盒说明书。所提取DNA使用紫外分光光度计测定A260及A280，A260/A280值1.6～1.8为合格样本，-20 ℃保存基因组DNA样本。

1.2.2 全外显子组测序 全外显子组测序委托上海新培晶医学检验所完成。每例患儿取15～20 μg基因组DNA样本，采用超声打断仪（Covaris s2，Massachusetts，USA）将基因组DNA随机打断成主代200 bp左右片段，取1 μg提纯的DNA片段进行末端修复并连接上标记性接头，构建DNA测序文库。按照illumina标准建库方法行3步酶促反应形成样本文库[7]。

序列捕获采用罗氏全外显子液相芯片（NimbleGen SeqCap EZ Exome V3 芯片，Roche，64 M）并按照供应商提供的标准实验流程进行[8]，混合后的文库在42 ℃条件下杂交16～20 h。然后进行洗脱、纯化后PCR扩增即得到序列捕获后的产物，上机测序（Illumina HiSeq ×10），平均测序深度150～200×。

1.2.3 全外显子组数据处理和生物信息学分析 用Illumina Pipeline software（version1.3.4）读出原始测序数据，首先进行包括图像识别、碱基识别、过滤接头序列和检测可能的样本污染等基本数据处理，然后进行生物信息学分析。生物信息学及突变分析方法为：GATK、SAMTools、SIFT、PolyPhen2、LRT、Mutation-Taster等。主要步骤包括：处理后数据与参考基因组比对，找到单一比对到基因组上数据序列，将其与外显子组区域再比对，随后进行目标区域中单碱基深度分布和覆盖度均一性分析。突变数据库来源包括：1000 Genomes Project、dbSNP、ClinVar、ESP6500、ExAc、Ensembl、HGMD、UCSC等。同时应用SIFT在线预测工具（http://sift.icvi.org/）和Polyphen-2软件预测突变对蛋白质功能的影响。

对于发现的突变位点结合文献[2，9-12]及软件分析结果，将突变区分为以下4类：（1）文献报道与疾病明确相关的突变位点；（2）与疾病可能相关的突变位点；（3）意义不明确的变异位点；（4）无致病性变异位点。（1）+（2）两类突变被认为是致病基因候选突变位点。

1.2.4 致病突变位点Sanger测序 测序所得致病候选突变位点，通过http://www.ncbi.nih.gov/查询到相应基因的GeneBank外显子序列、采用Gene Tool软件对每个候选突变区域进行引物设计，引物由生工生物工程股份（上海）有限公司合成。以基因组DNA为模板，扩增目的DNA片段，所得的PCR产物经过纯化及鉴定后，加入BigDye® Terminator v3.1（ABI）进行PCR扩增并上机测序，与GeneBank数据库提供的mRNA标准序列比对，进行突变位点鉴定。

1.3 数据统计

10例患儿测序结果的突变数、与疾病相关突变数、测序深度使用SPSS 19.0进行列表分析，数据采用均数±标准差表示，中位水平采用中位数（范围）表示。

2 结果

2.1 DNA提取

10例石蜡包埋组织样本切片厚度5 μm且每例组织样品切片5张以上，每张切片经基因组DNA提取，均成功提取到基因组DNA。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，所获得的基因组DNA样本均质量良好，且数量足够完成本研究、留取标本复核及建立组织样本库为后续研究做准备。

2.2 外显子组测序结果

采用罗氏全外显子液相芯片对10例T-LBL患儿进行外显子组捕获及测序，总体测序深度为182.73±69.89，中位测序深度165.19（89.52～347.28）。测序输出的原始数据与参考数据库中的外显子基因组序列进行比对，得到与致病相关的突变位点序列。通过序列比对分析发现10例患儿每例均有突变，例均突变数34.20±9.90，10例患儿中位突变数32（20～48）。每例患儿均发现潜在致病突变（表1），例均疾病相关突变2.30±1.06，10例患儿疾病相关突变中位数2（1-5）。上述疾病相关突变涉及基因合计16种，其中文献报道[9-12]与疾病明确相关的突变基因共10种，包括：JAK3、FBXW7、ETV6、CDKN1B、NOTCH1、BCOR、DMBT1、NF1、PHF6和KMT2D，与疾病可能相关的突变基因[13-15]共6种，包括：TSC1、CDH1、FLG、SMARCA4、RASA2和USH2A。所有致病突变经过Sanger测序验证均确实存在于患儿基因组。

表1 10例T-LBL患者疾病相关基因突变

3 讨论

T-LBL是儿童期非霍奇金淋巴瘤的常见亚型，DNA损伤导致的体细胞突变是包括T-LBL在内的恶性肿瘤细胞特异的分子生物学标记[16]。初诊时确定肿瘤细胞特异性标记可以指导治疗方案选择及判断预后，如FBXW7阳性T-LBL预后较差，可能需要采用异基因造血干细胞移植在内的强化治疗方案[2]。本研究中10例患儿经测序发现多种肿瘤相关基因变异，其中JAK3[16]，NOTCH1[2]，ETV6[16]等基因均报道与血液系统肿瘤发生相关，而FBXW7则是T-LBL中常见与预后密切相关且对临床诊疗方案具有指导意义的基因。

U-淋巴瘤经过治疗后体内仍剩余有肿瘤细胞，即微小扩散病灶[17]，治疗后微小扩散病灶水平为判断治疗反应、危险度分级以及指导进一步化疗、指导造血干细胞移植指征选择等提供了一个客观直接的量化指标，是淋巴瘤独立的预后因素[18]，既往主要采用CT、PET-CT等影像学检测方法评估淋巴瘤微小扩散病灶水平，但其灵敏度及特异性均较低[19]，如果病初确定T-LBL标志性的肿瘤突变，治疗后采集外周血检测循环肿瘤DNA，可以为指导治疗提供更加灵敏可靠的监测手段[20]。本研究队列中10例患儿均发现疾病潜在相关突变，平均为2.30（1～5）个，提示基因组疾病相关突变对于微小扩散病灶分析具有潜在价值。但本文未对患儿正常组织进行测序分析，尚不能分辨上述潜在突变系遗传突变还是体细胞突变，随访过程中需要对正常组织测序以进一步确定上述变异是否为肿瘤细胞特异性改变，明确其微小扩散病灶监测价值。

有研究认为T-LBL和T-ALL系相同疾病的不同表现，目前已经发现超过20种肿瘤标记与T-LBL/TALL发病及预后有关[9-12]。诊断为T-ALL的患者骨髓中存在大量肿瘤细胞，采集骨髓液提取基因组DNA可进行测序分析，但目前国内诊断为T-LBL患者病理标本多采用福尔马林固定后行石蜡包埋，故难以获得保存良好的新鲜肿瘤组织，随着保存时间的延长，基因组DNA不断破坏，限制了肿瘤细胞突变的检测[21]。本研究对一个10例T-LBL的包埋样本进行了WES分析，分析结果表明样本可以用于测序分析，且能够达到理想的测序深度用于后续基因组数据分析。同时，测序结果表明所有患儿均具有肿瘤相关基因突变，人均2.30个，较常见B细胞类群淋巴瘤为少，而与儿童白血病接近，NOTCH1，PHF-6以及FBXW7等基因也为T-ALL常见突变基因，均提示该类样本WES分析的可靠性较高，具有临床应用价值。

T-LBL体细胞突变类型较多，传统的基因突变检测系采用Sanger测序法逐一检测致病突变，该方法耗时费力、费用较高，且不能发现新的致病突变[22]。多数肿瘤的致病突变集中在仅占全基因组不到2%的各基因外显子编码区序列，对编码区序列检测即为WES[23]。随着新一代测序技术NGS的发展，WES测序效率得到显著提高测序成本不断下降[24-25]，为采用NGS对T-LBL进行WES检测提供了可能。本研究中发现的基因变异，除了常见于T-LBL的突变基因NOTCH1，FBXW7，PHF6等以外，更是发现多种肿瘤相关基因突变，且均为错义、移码等突变类型，具有功能意义，对于临床有重要提示作用。

本研究在国内首次采用石蜡包埋的T-LBL病理组织提取基因组DNA，并使用NGS技术对10例TLBL患儿行WES测序，建立了标准的检测方案。通过生物信息学对WES测序结果进行分析并确定致病突变位点后，采用Sanger测序进行复核，结果显示本研究采用的检测方案可以高效的检测出T-LBL致病位点，为进一步研究T-LBL发病机制及治疗打下基础。