西藏拟溞Daphniopsis tibetana核糖体18S和ITS2序列克隆及进化分析

史楠冰， 赵 文， 刘卫东， 魏 杰， 安 浩， 季世琛

(1. 大连海洋大学 水产与生命学院， 大连 116023； 2. 辽宁省海洋水产科学研究院， 大连 116023)

西藏拟溞在分类学上隶属于甲壳纲(Crustacea)，鳃足亚纲(Branchiopoda)，双甲目(Diplostraca)，枝角亚目(Cladocera)，溞科(Daphniidae)，拟溞属(Daphniopsis)[1]。该种通常分布于高海拔、低温、低盐的贫营养型盐水体中[1]，在我国新疆、青海、西藏等地均有分布，国外则分布于俄罗斯和印度，是一种冷水性盐水种，在枝角类生物学研究中具独特地位[2]。

传统的枝角类物种鉴别方法主要依靠形态学观察，随着分子生物学的发展，一些特定基因序列和分子标记被用于物种鉴定和物种进化关系的研究，其中包括线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(mtCOI)序列、ITS序列以及18S rDNA序列[3]。线粒体DNA细胞色素c氧化酶亚基I(mtCOI)部分序列在动物界的大多数门类中具有种的特异性，被公认为动物的“条形码”， 而转录间隔区(internal transcribed spacers，ITS)序列由于选择压力小，进化变异速率较快，更适用于物种和种群等低阶水平的系统发育关系的研究[4]，这一序列多被用于真菌的分类鉴定[5]。真核生物18S rDNA基因由于序列在进化上极度保守，同属异种间序列差异小，通常被认为更适用于高阶分类水平[6]。由于核18S rDNA基因颇具保守性，可用通用引物进行扩增并测序，现已频繁用于真核生物多样性及进化研究[7]。Genbank中18S序列构成了物种覆盖面最为广泛的数据，而间隔区ITS序列数据相对较少，数据库资源较为缺乏。

目前国内外学者对西藏拟溞生物学研究主要包括生态分布[1]、形态学描述[2]、营养成分分析[8]、耗氧率排氨率测定[9]、免疫学相关[10]、金属离子耐受性[11-13]、染色体核型[14]，以及基于RAPD技术的遗传多样性[15]等方面。在分子研究方面，西藏拟线粒体COI部分序列、16S rDNA部分序列以及12S rDNA部分序列已有相关报道研究[16-17]，对于18S rDNA及ITS序列的研究尚无相关报道。

本研究首次对西藏拟溞核糖体18S rDNA部分序列和ITS2全长进行克隆测序，依据核糖体18S rDNA序列构建了系统发育进化树，这些结果为该种的分类鉴定、进化演变及进一步分子生物学研究提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 西藏拟溞采集及培养

西藏拟溞样本是2016年8月采自于西藏自治区那曲纳木卡错湖(30°30′N，90°16′E)，驯养于大连海洋大学水生生物学重点实验室。

西藏拟溞家系培育： 1000 mL大烧杯灭菌海水配以纯水调节盐度至15作为培养用水，每个烧杯加入上述培养水约400 mL水。每个烧杯放入一只经挑选的状态良好的个体，经孤雌生殖连续繁殖培育西藏拟溞家系。以湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)和盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)按比例1∶1做混合藻作为饵料投喂，每3天投喂1次，随着溞体数量调整每次饵料投喂量。

1.2 西藏拟溞总DNA提取和目的基因PCR扩增

实验前一天停止投喂，将家系导入新配置的盐度为15的海水中，饥饿处理24 h，每个家系分别挑取10～20个西藏拟溞个体，用于基因组DNA提取，按照海洋动物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN生化科技有限公司)的说明书进行DNA抽提，所得DNA用50～60 μL灭菌水最终洗脱。提取出的基因组DNA于-20℃保存。另挑取4只个体较大，游泳活泼的个体，提取单只西藏拟溞的基因组DNA用于扩增ITS2序列。

经文献查询获得扩增西藏拟溞18S和ITS2序列通用引物, 引物由上海生工生物有限公司合成。扩增引物序列分别为：18SF(AYCTGGTTGATCCTGCCAGT),18SR(CCTTGTTACGACTTTTACTTCCTC),ITS2F(GGTCGATGATGAACGAACAGAGAT),ITS2R(GGTAGTCTCATCTAAACTGAGGTCAGA)。

PCR扩增反应使用50 μL体系，各组分含量按照LATaq酶(TaKaRa 大连)说明书配置。PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸3 min，设32～34个循环。反应结束后，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目标条带进行切胶纯化(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)。纯化产物经连接PMD19-T(TaKaRa 大连)、转化E.coliDH5α(TaKaRa 大连)、培养、筛选及验证后，克隆菌液送上海生工生物公司测序。

1.3 西藏拟溞核糖体18S序列和ITS2序列测定与系统发育分析

18S rDNA序列同源性通过BLASTn在NCBI检索相似序列并用于系统发育分析，所选序列如下：与西藏拟溞同属不同种的方角拟溞Daphniopsisquadrangula，同科不同属的大型溞Daphniamagna、蚤状溞Daphniapulex、喜马拉雅低额溞Simocephalushimalayensis、平突船卵溞Scapholeberismucronata，同目不同科的弯额刺尾溞Acantholeberiscurvirostris、Bythotrephescederstroemi、Pseudochydorusglobosus；和西藏拟溞同纲不同目无甲目的Parartemiaminuta、Linderiellasantarosae，外族群为虾夷扇贝Mizuhopectenyessoensis。本文选用的12个物种的核糖体18S基因序列GenBank登录号见表1。

表1 构建进化树所用12个物种18S rDNA基因序列及GenBank登录号

用ClustalW软件对西藏拟溞18S序列及建树所需18S序列进行多序列比对。应用MEGA5.0软件计算各物种18S rDNA间的遗传距离。根据12个物种的18S rDNA对结果，构建西藏拟溞的系统发育进化树，并在此基础上分析西藏拟溞的进化分类地位。使用ModelTest 确定计算遗传距离和建树的最佳模型。经检验基于西藏拟溞18S rDNA构建系统发育进化树的最佳模型是Kimura双参数模型(kimura,1980)，采用最大似然法(ML)构建系统发育树，用自举检验(bootstraptest)估计各分支节点的置信度，自举数据集为1000次重复，使用离散Gamma分布来模拟各站点之间的进化速率差异[5个类别(+G，参数=0.2416)]。

ITS2区域的边界是通过BLASTN与GenBank数据库中的其他种类的ITS2序列比对来确定的。保守序列的边界如果与GenBank数据库中的rDNA序列的边界是100%相似的，它就被认定为是代表5.8S、18S和28S基因侧翼区，以此来确定ITS2序列边界[18]。

2 结果与分析

2.1 序列信息与核酸组成

本研究所得西藏拟溞家系18S rDNA和ITS2序列及3个西藏拟溞个体ITS2序列的GenBank登录号、核酸组成及序列长度见表2。

表2西藏拟溞18S rDNA、ITS2序列组成及长度

2.2 西藏拟溞核糖体18S序列与拟溞属、溞属18S序列差异分析

本研究获得的西藏拟溞18S rDNA序列和以往研究结果一致，具有高度保守性，同一属的生物种间差异较小。西藏拟溞18S序列与拟溞属的方角拟溞和溞属的大型溞经ClustalW比对，手动去除两端序列，至两端对齐，得到长度为611 bp的可分析序列。结果如图1所示，“.”表示保守位点，统计结果显示：西藏拟溞18S序列与方角拟溞序列共有540个保守位点，46个可变位点，25个插入缺失位点；和大型溞 18S序列共有506个保守位点，36个可变位点，69个插入缺失位点。

表3 由Kimura双参数模型计算的12个物种18S rDNA序列间遗传距离

注：左下角数据表示两两之间的遗传距离

2.3 12个物种核糖体18S序列间遗传距离分析

18S rDNA各序列之间的遗传距离用MEGA5.0软件，用核苷酸序列来计算距离矩阵，应用Kimura双参数模型计算出的12种生物18S rDNA序列间的遗传距离见表3。由表3可知与西藏拟溞亲缘关系最近的是拟溞属的方角拟溞，其次为溞属的大型溞和蚤状溞。

2.4 系统发育进化分析

根据核糖体18S序列构建的系统发育进化树如图2所示， 12个物种聚集形成两大分支 ， 2个无甲目的物种P.minuta、L.santarosae聚集形成一大分支，9个双甲目的物种聚集成一大分支，西藏拟溞聚集在该分支上。

图1 3种枝角类核糖体18S rDNA序列变异位点

从进化树可以看出西藏拟溞和拟溞属的方角拟溞亲缘关系最近，以92%置信度聚集在同一分支，这表明西藏拟溞应与方角拟溞归于同一属；大型溞和蚤状溞聚集在一起，单独形成一个分支与西藏拟溞所在分支平行，再次证实了西藏拟溞在分类学上不归属于溞属。平突船卵溞和喜马拉雅低额溞分别单独形成一个分支，并与西藏拟溞所在分支平行，这与传统分类学上归属于溞科(Daphniidae)一致；弯额刺尾溞和P.globosus聚集形成一个分支远离西藏拟溞所在分支；B.cederstroemi单独成一分支，归属于同一目双甲目，这与传统分类学结果一致(图2)。

2.5 西藏拟溞家系与个体间ITS2序列差异分析

西藏拟溞家系与3个个体间ITS2序列通过ClustalW比对，手动对齐后获得长度为1212 bp可分析序列，结果发现西藏拟溞个体间ITS2序列存在碱基和长度差异见表4。4个序列中共有1176个保守位点，存在多个变异位点，其中AG 的替换突出，其次是T与C的替换，另外在3个个体序列中，361～366 bp位置出现TTGTGG片段缺失，874～879 bp位置上一致出现了GCAGCA片段的缺失。

图2 基于核糖体18S序列构建的系统发育树

4043160207316359360361～366367381419448536KY849847AAGAGGGTTGTGGTGCAGKY849848AAAGGGG-TATGGKY849849GAGAAGG-TGTAGKY849850AGGAG----GTAA542605625632650713874～8799419741028102910471092KY849847--CT-AGCAGCATGAAAGKY849848AATTTA-T-A-AGKY849849--T-TA-TGA-AAKY849850--T--G-GG---G

注：表中“-”代表该位点碱基缺失

2.6 ITS2序列长度多态性

西藏拟溞家系和3个个体ITS2序列，和经BLASTN在线比较获得GenBank数据库中已有的相近物种的ITS2序列(GenBank中未找到拟溞属的ITS2序列信息)，与西藏拟溞同科不同属的头盔溞Daphniagaleata、僧帽溞Daphniacucullata，与西藏拟溞同目不同科的长额象鼻溞Eubosminalongicornis、长角象鼻溞Eubosminacrassicornis、乡蚌虫Eulimnadiatexana，不同纲的人疥螨Sarcoptesscabiei、皮刺螨Dermanyssusgallinae、真桑小新绥螨Neoseiulusmakuwa。相关物种的ITS2序列信息及长度见表5，由表可看出ITS2序列长度在同种不同个体之间存在一定差异，西藏拟溞与头盔溞D.galeataITS2 序列长度差160 bp左右，与僧帽溞D.cucullataITS2差异明显，与长额象鼻溞E.longicornisITS2差异更大，这一现象是由于ITS区的选择压力小，变异速率更快导致的。

3 讨论

西藏拟溞由Sars[24]对亚洲中部的枝角类调查中首次发现的，并将其归属于拟溞属并命名为西藏拟溞，而Wagler[19]却将该溞归属于溞属，命名为西藏溞Daphniatibetana，由此出现这种枝角类分类学上的争论。赵文等[16]通过对4个品系西藏拟溞的线粒体12SrDNA基因序列分析，揭示了该种与溞属在线粒体12SrDNA分子上的差异，并结合传统分类学上的差异，证明了西藏拟溞应归属于拟溞属。但是，线粒体基因遵循严格的母系遗传，其所含信息不能说明双亲的进化历程，而控制大部分生物性状的核基因则含有更丰富的进化信息[20]。Kuriiwa等[21]研究时发现，从核DNA筛选的合适标记能够提供父系起源信息，揭示杂交现象，从而更全面的体现物种系统进化历程。本研究获得的西藏拟溞18S rDNA和ITS2序列经分析再次证明了，西藏拟溞在分类水平上更靠近拟溞属而非溞属，这与赵文等的研究结果一致。

表5 ITS2序列信息及长度

18S rDNA分子常作为真核生物分子标记用于解释物种水平关系和高阶桡足类系统发生的分析[22]。18S rDNA序列可以很便捷地解析物种属之间进化关系，但是，由于核糖体RNA基因的分子进化的总体速率慢，导致物种关系之间较低的置信度，不能有效解决属内的进化关系[23]。

本研究通过ClustalW多序列比对和遗传距离计算，遗传距离比较发现西藏拟溞和拟溞属的方角拟溞之间的遗传距离最小。系统发育树显示，相对于溞属的大型溞的18S序列，西藏拟溞的18S序列和同属的方角拟溞18S序列同源性更高，亲缘关系更近。核糖体18S基因进化是缓慢的，不同目物种之间的遗传距离几乎是同目不同科物种之间的2倍。

第二转录间隔区ITS2位于5.8S和28S rRNA之间，由于不加入成熟核糖体加工，受到的选择压力更小，比编码区进化速度快，具有种内变异小种间变异大的特性，常作为种类鉴定和系统发育分析的分子标记[24]。徐敏[25]在分析7种枝角类ITS2序列时，发现ITS2基因存在种内差异，透明溞5个个体的平均相似度为96.8%，存在碱基和长度差异。由于该特性，ITS区适合于相近种和同种的不同地理种群及不同品系的研究。范凤娟[26]对来自不同地区的55个象鼻溞个体的核基因ITS区进行研究，结果发现以甘肃的炳灵湖、四川的雅安和贵州为分界线呈现明显的地理分化现象。在菌类的分类鉴定研究中，ITS序列常作为一些种和亚种的鉴别标记[27]。

本研究获得的西藏拟溞ITS2序列符合真核生物rDNA内部转录间隔区种内变异小而种间变异大的特性，即使是个体间ITS2序列也存在碱基和长度差异。ITS2区域内含多个变异位点而导致该区域在种群和物种水平上进化速率非常迅速，不同种序列之间存在明显的长度多态性[28]。本研究获得的西藏拟溞ITS2序列和同科不同属的头盔溞序列在长度差了560 bp左右，和不同科不同目的物种序列长度差异更大。

由于ITS2序列的可变性导致该区种间的同源性低，不适合属、科等高阶分类阶元的进化分析，而适应于低分类阶元的分析。该区域富含的变异和位点信息，在物种的遗传多样性研究，系统分类领域、种和亚种的鉴别标记等方面具有广阔应用前景。