全层铺片技术显示胃肠道不同部位Cajal间质细胞*

孙海梅 孙婷怡 杨 姝 吴 波 季凤清 周德山

(首都医科大学基础医学院人体解剖学与组织学胚胎学系,北京 100069)

Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC),是西班牙神经解剖学家Santiago Ramony Cajal于1893年首次在胃肠道中发现的一类特殊间质细胞,与胃肠道平滑肌和神经纤维末梢在解剖学上有紧密联系,具有独立功能,既是胃肠起搏细胞,又具有传导神经递质的作用[1]。ICC广泛存在于哺乳动物的整个消化道管壁内,按分布区域可大致分为：分布于胃、小肠和结肠内的环肌与纵行肌之间的肌间神经丛ICC;位于黏膜下环肌层表面的ICC;位于小肠深肌丛区域的ICC;广泛散布于环肌和纵肌肌束内的ICC[2]。

目前消化道全层铺片技术由于能够直观、全面地显示ICC的分布、形态以及形成的细胞网络,而成为研究胃肠神经系统的重要方法之一,但文献中却鲜少提及此方法的详细操作过程。已知ICC特异性表达由原癌基因c-kit编码的受体酪氨酸激酶即c-kit蛋白控制,所以,c-kit蛋白常被用作标记ICC[3]。本研究在传统全层铺片制作技术的方法上进行摸索和改良,结合c-kit 免疫荧光染色显示小鼠胃肠道内不同位置ICC的形态,为从事相关研究的同行提供参考。

1 材料和方法

1.1 动物

选用C57BL/6J小鼠,8～10周龄,雌雄不限,由首都医科大学动物部提供(实验动物编号AEEI-2016-143)。

1.2 试剂

牛血清白蛋白BSA(中杉金桥生物技术有限公司);大鼠抗小鼠c-kit单克隆抗体ACK2(1∶200,eBioscience公司);Cy3标记的羊抗大鼠IgG(1∶300,Invitrogen公司)。

1.3 取材固定

小鼠取材前12h禁食。颈椎脱臼法处死小鼠,腹正中切口暴露腹腔,快速取出胃、空肠和结肠,置于放有4℃预冷0.01mol/L的PBS的平皿中,用注射器PBS反复注入胃或肠腔内冲洗,以充分去除腔内容物,分别待制备冷冻切片和铺片。

1.4 冷冻切片制备

将冲洗好的胃组织剪成约0.5cm×0.5cm的组织块,浸入放有OCT的包埋模具中,迅速投入液氮,数秒后待液氮沸腾停止,取出组织立即放入-20℃保存备用或直接恒冷箱冷冻切片,切片厚度7μm,APES载玻片贴片,吹干,丙酮固定15min后进行染色。

1.5 铺片制备

将冲洗好的胃肠道组织分别用手术线结扎胃贲门端或肠管一端,用注射器将4℃预冷的丙酮固定液注入胃或肠腔内,使其维持适当充盈状态,结扎胃幽门端或肠管另一端,置入丙酮固定液中固定24h(图1)。制备全层铺片前去除结扎部分,将胃沿小弯侧剪开或沿肠系膜缘剪开肠管,取胃体和胃窦的中间1/3部分及肠管制作全层铺片。于体视解剖显微镜下,用钟表镊依次剥离黏膜层、黏膜下层,再将环行平滑肌层与纵行平滑肌分离,并剪成适当大小的组织块,置于0.01mol/L的PBS中保存备用。

1.6 免疫荧光染色

将制备好的冷冻切片(胃)和全层铺片(胃、小肠、结肠)用0.01mol/L 的PBS漂洗5min×3次;1%BSA室温孵育1h,以降低非特异性染色;弃去多余孵育液,滴加0.1%BSA稀释的一抗,放置于湿盒内4℃过夜;次日,0.01mol/L的PBS漂洗5min×3次,滴加0.1%BSA稀释的荧光标记二抗,湿盒内室温避光孵育1h;0.01mol/L的PBS漂洗5min×3次,染好的铺片组织用自制铺片转移托转移到载玻片上,与染好的冷冻切片均用水溶性荧光封片剂封片,于荧光显微镜下进行观察。

2 结果

红色荧光标记的细胞为c-kit蛋白阳性的ICC(图2),应用冷冻切片进行免疫荧光染色,不能清晰显示胃壁内不同部位ICC形态。为清晰显示ICC的形态结构,继而进行全层铺片的免疫荧光染色(图3～5),结果表明,网状分布于胃(图3A)、空肠(图3B)和结肠(图3C)的肌间神经丛ICC,其胞体呈梭形或星形,细胞核呈圆形,有2～4个细长突起,突起反复分支,彼此间相互连接形成致密复杂的细胞网络;广泛散布于胃(图4A)和结肠(图4B)的环纵肌束内ICC,其胞体呈梭形,细胞核椭圆,有2个细长的突起,走行与细胞轴长轴一致;位于空肠深肌丛区域的ICC(图5A)数量较少,所形成的细胞网络较稀疏;位于结肠黏膜下环肌层表面的ICC(图5B),其胞体形态不规则,胞体较大,多个细长突起交织成独立的细胞网络。

图1 丙酮充盈的小鼠胃(A)和小肠(B).

图2 冷冻切片显示小鼠胃壁内ICC,标尺=100μm.

图3 全层铺片显示小鼠胃(A)、空肠(B)、结肠(C)肌间神经丛ICC,标尺=100μm.

图4 全层铺片显示小鼠胃(A)、结肠(B)环纵肌束内ICC,标尺=100μm.

图5 全层铺片显示小鼠空肠深肌丛ICC(A)、结肠黏膜下环肌层表面ICC(B),标尺=100μm.

3 讨论

切片技术是形态学研究的传统、经典实验技术,但存在一定的局限性,很难客观反映某些器官、组织或细胞的全貌。比如分布于消化管道的肠神经系统,因其网状结构的特殊性,难以应用普通切片从某一断面观察神经细胞[4]。全层铺片技术早期一般应用于虹膜、肠系膜、小血管等较薄的膜状组织的制片,而对于较厚的组织少有应用。本实验将消化道全层铺片技术用于显示胃肠道不同部位ICC,染色结果证实该方法较切片具有明显优势,能够直接暴露肌内、肌间ICC,从而完整观察其形态和分布,并能直观显示ICC的细胞密度和所形成的细胞网络。

以往文献虽然对多种实验动物的ICC显示方法进行过研究,但缺乏对铺片制作过程及注意事项的详细介绍,同时鲜见对小鼠消化道不同部位ICC铺片染色对比观察的研究。本实验在不断改进铺片制作技术的过程中,总结了如下铺片技术的关键要点：(1) 由于组织的结构特点,取材时不同器官或同一器官不同部位对于制作好的铺片标本有一定影响,如与胃窦相比,胃底和胃体更易铺片,靠近胃大弯侧要比胃小弯侧容易铺片,小肠近回盲部的位置最易铺片;(2) 取材时需要对胃肠道进行充分地充盈固定,有助于腔壁的肌层变薄,易于染色,且成片后效果较好;(3) 制作铺片标本是在解剖显微镜下的精细操作,所以选择尖细的进口钟表镊有助于精准地分离组织。

本研究通过应用全层铺片技术,结合免疫荧光染色,并运用荧光显微镜进行观察,能够清晰、全面的显示胃肠道各部位ICC的形态和密度,精确度较高,可以为实验结果的准确性打下良好基础,并对深入研究ICC与胃肠运动以及相关疾病的关系具有重要意义。