石榴3—脱氢奎尼酸合成酶基因的克隆及表达分析

尹燕雷　陶吉寒　杨雪梅

摘要：利用RT-PCR技术从泰山红石榴（Punica granatum L.）果皮中获得3-脱氢奎尼酸合成酶（DHQS）基因cDNA序列，分析了其在不同石榴品种发育期果实中的表达情况。结果表明，DHQS基因cDNA序列长273 bp，编码91个氨基酸，编码蛋白具有典型的DHQ_Fe_ADH超家族保守结构域。该基因核苷酸序列与欧洲山毛榉、梅花和蒺藜苜蓿的相似性分别为91%、87%和88%，氨基酸序列与欧洲山毛榉、苹果、白梨和拟南芥的相似性分别为95%、92%、92%和88%。两个石榴品种发育期果皮中DHQS基因相对表达量逐渐降低，均在7月15日出现峰值。整个发育期，泰山红DHQS基因表达量高于泰山三白甜。

关键词：石榴（Punica granatum L.）；3-脱氢奎尼酸合成酶；克隆；表达分析

中图分类号：S665.4 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）18-0103-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.026 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and Expression Analysis of 3-dehydroquinate Synthase Gene in Pomegranate

YIN Yan-lei，TAO Ji-han，YANG Xue-mei，TANG Hai-xia，FENG Li-juan

（Shandong Institute of Pomology，Tai'an 271000，Shandong，China）

Abstract： The 3-dehydroquinate synthase（DHQS） cDNA sequence was cloned from Taishanhong pomegranate（Punica granatum L.） pericarp with RT-PCR technique. The expression of DHQS gene was analyzed in different pomegranate cultivars fruits during development. The result showed that the cDNA sequence length of DHQS was 273 bp，which encoded 91 amino acids. The protein of DHQS gene contained DHQ_Fe_ADH superfamily conservative structure domain. The similarity of DHQS nucleotide sequence in pomegranate and Fagus sylvatica，Prunus mume，Medicago truncatula were 91%，87% and 88%，respectively. The similarity of DHQS deduced amino acid sequences in pomegranate and Fagus sylvatica，Malus domestica，Pyrus x bretschneideri，Arabidopsis thaliana were 95%，92%，92% and 88%，respectively. The relative expression level of DHQS gene decreased gradually with the fruit development in two pomegranate cultivars，which peak value appeared at July 15th. The relative expression level of DHQS gene in Taishanhong was higher than that in Taishansanbaitian in the whole development period.

Key words： Punica granatum L.； 3-dehydroquinate synthase； cloning； expression analysis

石榴（Punica granatum L.）種质资源丰富，适应性强，在热带、亚热带和暖温带地区都有栽培[1，2]。没食子酸、咖啡酸和绿原酸等是石榴中含量较为丰富的酚酸类物质，具有诸多保健功能，逐渐成为目前研究的热点。

莽草酸途径与没食子酸、咖啡酸和绿原酸的生物合成密切相关[3，4]。3-脱氢奎尼酸合成酶（3-dehydroquinate synthase，DHQS）是莽草酸途径中的第2个关键酶，能催化3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，DAHP）生成3-脱氢奎尼酸（Dehydroquinate，DHQ）[5]。DHQ既参与合成没食子酸的前体物质3-脱氢莽草酸，又参与合成绿原酸的前提物质奎尼酸和咖啡酸[6，7]。对DHQS基因进行克隆与表达分析为从分子水平揭示植物中酚酸类物质代谢机理提供了理论依据。

目前，DHQS活性测定、基因克隆表达方面的研究在原核生物和真核生物中[8-10]研究较多，植物中DHQS生化特性、分子结构及基因克隆表达的研究仅在猕猴桃[5]、狭叶松果菊[7]、欧洲山毛榉[11]和柿子[12]中有少量报道，苹果、梨等果树上DHQS基因序列主要通过全基因组测序预测得到，石榴中DHQS基因克隆及表达方面的研究至今未见报道。因此，本研究利用RT-PCR技术克隆泰山红石榴果皮DHQS基因cDNA序列，对其在不同品种中的表达情况进行荧光定量PCR分析，为揭示石榴果实中酚酸类物质代谢的分子机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种均采自山东省果树研究所石榴种质资源圃。基因克隆以泰山红幼果期果实（直径2～3 cm）为试材，果皮用液氮冷冻后储存于-80 ℃中备用。

荧光定量表达分析以泰山红和泰山三白甜不同发育时期的果实为试材。2016年7月15日开始采样，每隔10 d采1次，直至10月2日成熟时为止。每品种选长势一致的健壮树10株，每次采均匀、无病虫害的果实10个，采后低温条件下带回实验室，果皮液氮冷冻后，于-80 ℃保存。

1.2 保守片段的克隆

利用RNA prep Pure Plant Kit试剂盒提取果皮总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，Nanodrop 紫外分光光度计检测其质量。按照Thermo Scientific Fermentas反转录试剂盒K1622说明书合成cDNA 第一链。

根据已知DHQS基因的保守序列设计简并引物DHQS1：5′-RARRCATGTYCAYGGDAAGA-3′和DHQS2：5′-MCATHACVGTNGTDGGRATCTG-3′。PCR反应体系为2×Ex Taq Buffer 25 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 5 μL，Ex Taq酶1.0 μL，去离子水15 μL，总体积50 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将目的片段克隆至pMD18-T Vector送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得中间片段序列[13]。

1.3 序列分析

利用ORF Finder预测序列的开放阅读框；利用DNAMAN分析序列编码的蛋白质序列；利用NCBI的BLASTn和BLASTp分析拼接序列核苷酸和氨基酸序列的相似性；用CDD 进行蛋白保守结构域分析。

1.4 荧光定量PCR分析

使用天根RNA prep Pure Plant Kit试剂盒提取不同时期石榴果皮总RNA，利用宝生物工程（大连）有限公司的反转录试剂盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA第一条链。以反转录cDNA为模板进行荧光定量PCR。

分别以两个品种不同时期果皮cDNA为模板，根据获得DHQS基因序列设计实时荧光定量PCR 特异引物DHQS3：5′-TTAACTAAGGGAAACCCAA ATGTC-3′和DHQS4：5′-AAAGAGGCAGCAGCAAA ACC-3′。荧光定量PCR反应体系按SYBR？誖 Green PCR Master Mix说明书配制，每个样品设3 个重复。反应体系为SYBR Green Master Ⅰ 10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，加去离子水至20 μL。PCR反应程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40个循环；最后退火至55 ℃，每隔7 s上升0.5 ℃至95 ℃，共81个循环。以石榴Actin（GU376750.1）为内参基因，每个基因扩增均有内参基因同时扩增，默认条件下读取Ct 值，采用2-ΔΔCT方法，计算其相对表达量。

2 结果与分析

2.1 石榴DHQS基因保守序列的克隆

以石榴果皮cDNA为模板，利用简并引物DHQS1和DHQS2进行PCR扩增，克隆得到一条长273 bp的目的片段（图1）。经测序和比对确定其是DHQS基因片段，该基因片段共编码91个氨基酸（图2）。

在NCBI数据库中，將DHQS基因片段的核苷酸序列进行比对，结果表明，其与欧洲山毛榉（Fagus sylvatica，Accession：DQ166522.1）、梅花（Prunus mume，Accession：XM_008243830.1）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，Accession：XM_003612164.1）的相似性分别为91%、87%和88%。将其氨基酸序列进行比对发现，其与欧洲山毛榉（Accession：ABA54866.1）、苹果（Malus domestica，Accession：XP_008352428.1）、白梨（Pyrus x bretschneideri，Accession：XP_009363469.1）和拟南芥（Arabidopsis thaliana，Accession：NP_8512

79.1）等的相似性分别为95%、92%、92%和88%。由此确认克隆到的片段为石榴果皮DHQS基因，GenBank登录号为KY200850。

2.2 保守结构域分析

CDD分析表明，石榴DHQS蛋白具有典型的DHQ_Fe_ADH超家族保守结构域（图3）。

2.3 不同石榴品种DHQS基因表达分析

两个石榴品种果皮中DHQS基因随发育时间的增加也呈逐渐降低的变化趋势，均在7月15日出现峰值（图4）。整个发育期，泰山红DHQS基因表达量高于泰山三白甜。在7月15日，泰山三白甜果皮中DHQS基因相对表达量与其他时期差异极显著（P<0.01）。

3 小结与讨论

本研究利用RT-PCR技术从石榴果皮中克隆得到DHQS基因保守片段，具有典型的DHQS基因特征结构域，这与茶树上[3]的研究结果一致。由于石榴果皮富含多糖多酚物质，提取RNA的纯度不能满足DHQS基因3′端和5′端序列克隆的需要，后续将改进试验方案，克隆得到DHQS基因全长cDNA序列。

不同石榴品种发育期果皮中DHQS基因的表达量逐渐降低，这与臭氧处理烟草中DHQS基因的表达趋势[14]基本一致。研究表明，臭氧处理条件下，欧洲山毛榉叶片中DHQS基因上调表达[11]，这种差异性可能与物种自身的特性有关。DHQS基因在狭叶松果菊花和叶中表达量较高[7]，在第三片茶叶中表达量最高，在顶芽表达量最低[3]。本研究分析了不同品种果皮中DHQS基因的表达情况，不同部位中DHQS基因的表达水平还需深入研究。

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