多粘类芽孢杆菌脂肽类抗生素合成与分泌机制研究进展

汪城墙 戴莉 刘凯 杜秉海 丁延芹

摘要：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是一种常见的植物根际促生细菌，对植物具有直接或间接生防作用，已在控制农业病害、促进作物生长等方面广泛应用。其可抑制植物病原菌，主要通过产生多粘菌素、杀镰刀菌素等脂肽类抗生素发挥作用。关于多粘类芽孢杆菌的脂肽类抗生素合成和分泌等促生相关分子机制的研究具有重要理论和应用价值。本研究综述了多粘类芽孢杆菌的分子遗传操作体系，多粘菌素和杀镰刀菌素合成基因簇的鉴定、表达调控基因的分析和分泌机制，并从脂肽类抗生素合成和分泌机制角度展望其今后的研究趋势。

关键词：多粘类芽孢杆菌；植物根际促生细菌；多粘菌素；杀镰刀菌素；分子机制；外排蛋白

中图分类号：S476.19 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0157-07

Abstract Paenibacillus polymyxa is a common plant growth-promoting bacterium that have direct or indirect synergistic effects. It has been widely used in controlling agricultural diseases and promoting crop growth. P. polymyxa can inhibit some plant pathogens mainly through the production of polymyxin， fusaricidins and other lipopeptide antibiotics. The study on the molecular mechanisms of the lipopeptide antibiotics production and secretion in P. polymyxa has important theoretical and practical value. In this review，we summarized the molecular genetic system of P. polymyxa， and the gene cluster identification， the analysis of regulation genes and the secretion mechanisms of polymyxin and fusaricidins. At last， we proposed the prospect of the mechanism of lipopeptide antibiotics synthesis and secretion.

Keywords Paenibacillus polymyxa； Plant growth-promoting rhizobacteria； Polymyxin； Fusaricidins； Molecular mechanism； Efflux transporter

我國农业生产中，大量化学农药和肥料的使用虽然增加了农业生产产值，同时也造成了土壤酸化板结、农产品农药残留等环境和食品健康问题，严重影响农业的可持续发展。因此，开发环境友好的生物农药和肥料就显得尤为重要。植物根际促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR）是一类生活在植物根际土壤或附生于植物根部的可直接或间接促进植物生长、增强植物对逆境胁迫抵抗力的微生物，在生物农药和肥料研制和生产过程中具有重要价值[1，2]。

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是一类具有防病促生作用的PGPR，为营兼性厌氧，可形成芽孢的低GC含量革兰氏阳性杆菌，广泛存在于作物根际土壤，对多种作物土传病害具有显著防治效果[2]，并可诱导植物系统抗性，是微生物医药、微生物环境修复、微生物农药和肥料研发领域非常重要的菌种资源[3]。多粘类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质，如抗菌物质、植物激素、胞外多糖、多功能水解酶等，其中，通过非核糖体肽途径由非核糖体肽合成酶（NRPS）合成脂肽类抗生素是多粘类芽孢杆菌发挥生防功能的重要渠道之一[4-6]。截至目前，国内外学者已进行了30株多粘类芽孢杆菌的基因组测序，其中有10株获得了全基因组序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Paenibacillus+polymyxa），并发现多粘类芽孢杆菌普遍含有脂肽类抗生素的合成和分泌基因[7]。大多数多粘类芽孢杆菌主要产生两种脂肽类抗生素，一类主要为多粘菌素（polymyxin）、粘菌素、环杆菌素等，只对细菌（主要是革兰氏阴性细菌）有抑制作用；另一类为杀镰刀菌素（fusaricidins）、多肽菌素等，对真菌和革兰氏阳性细菌均有抑制活性[4-6]。限制多粘类芽孢杆菌产生脂肽类抗生素的因素主要有胞内合成能力和向胞外的分泌能力。为了提高多粘类芽孢杆菌的脂肽类抗生素合成能力，大量研究已致力于培养条件等体外因素的优化以及对其合成基因簇的鉴定、结构改造[8，9]，探索其合成和分泌途径中的分子机制。多粘类芽孢杆菌也是类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）的模式生物，对研究和解析这一类微生物的功能具有重要价值。利用多粘类芽孢杆菌作为生产抗生素的细胞工厂，借助合成生物学工具，也可研发和合成新型或混合型抗生素，增强应用效果并提高使用安全性[10]。

本研究综述了国内外多粘类芽孢杆菌的分子遗传操作体系及其两种酯肽类抗生素产物多粘菌素、杀镰刀菌素合成基因簇的鉴定、表达调控基因的分析和分泌机制的进展，并展望了后续多粘类芽孢杆菌的分子机制研究趋势。

1 多粘类芽孢杆菌遗传操作体系的建立与优化 方便高效的遗传操作体系是研究多粘类芽孢杆菌合成和分泌脂肽类抗生素机制的基础。近年来，随着多粘类芽孢杆菌分子机制研究的深入，不同的研究团队在多粘类芽孢杆菌中已建立多种分子遗传操作体系，确保了基因功能研究和工程菌改造的可行性。

1.1 敲除体系的建立与比较分析

研究人员在多粘类芽孢杆菌中已先后构建了多种基因敲除体系。早期，通过构建携带筛选标记（如奇霉素、四环素、卡那霉素抗性标记等）的Cosmid或Fosmid基因组文库，借助λ-Red重组系统，在多粘类芽孢杆菌中成功敲除了fusA、pmxC、pmxD和pmxE等多种基因[11-15]。Li等[8，16]进一步借助Cre-LoxP体系在多粘类芽孢杆菌中构建了多基因连续无痕敲除系统，并实现了在一个细胞株内多个基因的连续敲除。目前，多粘类芽孢杆菌中比较常用的一种简化了的基因敲除方法是应用自杀性质粒。Kim等[11]使用变性的自杀质粒pGEM7Z-f+作为载体，以α-和β-淀粉酶为目标基因，分别以氯霉素和红霉素抗性盒作为筛选标记，在多粘类芽孢杆菌E681菌株中成功建立了简化的基因敲除系统。本课题组用在革兰氏阳性细菌和大肠杆菌中复制的温敏型自杀质粒pRN5101为载体，以pmxE和spo0A为目标基因，以氯霉素抗性盒作为整合筛选标记，红霉素作为去除质粒筛选标记，在多粘类芽孢杆菌SC2中亦成功建立了相似的基因敲除系统[17，18]。

1.2 超表达体系的初步探索

目前，在多粘类芽孢杆菌中仅开展了个别基因的回补表达验证工作[8，13，17]，基因超表达体系尚不完善，还不能对基因进行不同强度的精准控制。Kim等曾尝试使用大肠-枯草穿梭质粒pHPs9 表达α-和β-淀粉酶，仅部分回补了α-和β-淀粉酶缺失菌株的酶活力，分析原因是启动子p59的启动效果不充分造成的[11]；随后，Kim等优化了回补方法：从质粒pHcMc05上克隆得到1.7 kb片段，包含Pspac promoter和lacI 基因，同樣连接至质粒pHPs9中，得到IPTG诱导的pHPspac附加体质粒，成功用于E681的基因PPE00036、PPE01127、PPE01377和PPE04441的回补验证[15]。2013年，Li等[8]基于大肠-枯草穿梭质粒pUBC19，构建了可在多粘类芽孢杆菌SQR-21中存在的附加体质粒，以gfp为报告基因，研究了不同长度的fusA基因簇启动子的启动能力。多粘类芽孢杆菌是天然高效生产光学纯R，R-2，3-丁二醇的微生物，相关代谢合成研究较多，使用的启动子（如P43启动子）和表达载体一般来自枯草芽孢杆菌[19]。另外，Brito等[20]发现三个组成型异源启动子Ppyk、Pgap和Ptuf在多粘类芽孢杆菌中可以有效表达。由于在多粘类芽孢杆菌中尚缺乏完善的超表达体系，本课题组基于枯草芽孢杆菌表达载体pHY300PLK，使用gfp作为报告基因，在多粘类芽孢杆菌SC2中构建了启动子捕获载体，通过对多粘类芽孢杆菌SC2的基因组文库筛选内源性启动子，旨在建立内源启动子库并完善多粘类芽孢杆菌的基因表达系统（数据尚未发表）。

1.3 转化方法的研究

对从自然界中分离筛选到的野生型芽孢杆菌进行基因转化一般比较困难，再加上外源质粒的不相容性，严重限制了芽孢杆菌的基因工程改造。而多粘类芽孢杆菌可产生大量的胞外多糖，使基因转化比一般的芽孢杆菌更加困难。但经过国内外不同研究团队的不懈努力，通过优化一些芽孢杆菌的转化方法，在多粘类芽孢杆菌中已成功建立了转化体系，主要有电击转化、属间接合转移和碱金属离子转化[12， 15]。电击转化法广泛应用于革兰氏阳性细菌中，是目前多粘类芽孢杆菌中使用最为广泛的转化方法。本课题组使用该法在多粘类芽孢杆菌SC2中实现了多种质粒的较高效率转化[17]。近来，一个简单、便宜并且高效的细菌转化方法在多粘类芽孢杆菌中成功建立，此方法基于magnesium aminoclays结合质粒再转化多粘类芽孢杆菌，可以高效率地进行遗传转化[20，21]。本课题组发现此方法可实现野生型多粘类芽孢杆菌SC2的质粒转化，具有较大的应用前景。

2 多粘类芽孢杆菌的多粘菌素合成分子机制 多粘菌素被誉为防御革兰氏阴性病原菌的最后防线——超级药物，可直接裂解阴性菌细胞膜、融合内外层膜造成渗透胁迫并能够通过羟基自由基和氧化胁迫诱导细菌死亡[9，22]。近十年，大量研究集中在研发新型多粘菌素，降低副作用，提高应用安全性方面[10]。利用多粘类芽孢杆菌作为细胞工厂，对多粘菌素的化学结构进行分析和改造的研究也已开展多年，这为分泌途径中跨膜转运过程的研究提供了多粘菌素分子结构基础。

多粘菌素是由10个氨基酸组成的多肽（图1A），第10位的氨基酸L-Thr和第4位的2，4-二氨基丁酸（L-Dab）环化形成一个七肽环，氨基端被脂肪酸修饰（FA）。肽链中第3、6、7位氨基酸可变[13，24]，产生多粘菌素A、B、C、D、E等多种类型，其中，多粘菌素B和E已广泛应用于临床。多粘类芽孢杆菌具有保守的多粘菌素合成基因簇，但合成的多粘菌素类型差别较大。先后有不同的课题组对多粘类芽孢杆菌E681[24]、PKB1[13]、M-1[25]和SC2[26]等的多粘菌素合成基因簇进行鉴定和分析，多粘菌素合成基因簇pmx（图2A）组成为pmxA、B、C、D、E，其中pmxE、A、B三个基因直接编码合成多粘菌素的NRPS，pmxC、D两个基因编码ABC型分泌蛋白[24]。多粘菌素由NRPS直接识别4种前体氨基酸L-Dab、L-Leu、L-Thr和D-Leu并连接成多肽链的方式合成，然后通过分泌途径，借助于细胞膜上的转运蛋白出胞。NRPS是具有模块组件的合成酶，其模块的数量和排列顺序直接对应合成多肽的一级序列，对其模块的分子改造亦可产生不同活性的多粘菌素[23， 25]。Niu等[25]证明polymyxin P是M-1菌株抑制病原菌Erwinia spp. 的成分，包括 polymyxin P1和polymyxin P2两种组分。Shaheen等[13]鉴定了PKB1菌株的相应NRPS合成模块，证实其可产生两种新的多粘菌素B。

多种内源基因在多粘类芽孢杆菌合成多粘菌素过程中起到重要调控作用。多粘菌素B硫酯酶和spo0A等基因对多粘菌素B最终完整活性结构的形成起到重要的正调控作用[27]；一定高浓度前体氨基酸的存在会通过抑制多粘类芽孢杆菌内源多粘菌素E合成基因（如ectB、pmxA、pmxE等）的表达，从而抑制多粘菌素E的合成[28]；abrB转录因子可直接与pmxA的上游区域结合，直接抑制多粘菌素合成基因的转录[29]。目前，对多粘类芽孢杆菌的多粘菌素合成调控分子机制的解析，正在逐步深入开展。

3 多粘类芽孢杆菌的杀镰刀菌素合成分子机制 多粘类芽孢杆菌主要通过产生杀镰刀菌素杀除或抑制作物病原真菌（如：尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、黑曲霉Aspergillus niger等）和革兰氏阳性细菌（如：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus等）[4，5]。关于多粘类芽孢杆菌的杀镰刀菌素合成基因簇的解析、应用和化学结构分析研究已开展多年，现已明确杀镰刀菌素的分子结构基础。

多粘类芽孢杆菌的杀镰刀菌素合成基因簇比较保守，但类型却各有不同[30，31]。杀镰刀菌素的完整fus基因簇（图2B）包括10个基因[8]，其NRPS由其中的fusA基因直接编码，含有6个模块；杀镰刀菌素是含有6个氨基酸和一个2-胍基-3-羟基十五烷酸（GHPD）的环状多肽类抗生素（图1B），N端L-Thr1和C端D-Ala通过酯键相连成环，肽链中主要有3个可变位置，这些位置氨基酸残基的不同引起抗菌活性的差异[14]。

2009年人们正式开启了杀镰刀菌素合成过程的分子调控机制研究[4，32]，多种基因和化合物可显著影响多粘类芽孢杆菌的杀镰刀菌素合成。一定浓度的金属离子Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+和Cu2+等可以显著提高fusA基因的RNA表达量，提高杀镰刀菌素的合成能力[33，34]。Kim等[15]对菌株E681诱变筛选，分析并证明葡糖磷酸变位酶基因pgm的失活可以提高E681的杀镰刀菌素合成能力。而Li等[8]克隆并研究了fus基因簇的启动子区域，证实全局转录调控因子abrB可以通过接合在启动子区域降低SQR-21的殺镰刀菌素合成能力。Li等[35]通过在大肠杆菌中异源表达多粘类芽孢杆菌PKB1的杀镰刀菌素合成酶的第六模块，证实此腺苷酰化结构域可特异性识别和激活D-Ala；PKB1的杀镰刀菌素合成过程中，D-型氨基酸被直接激活，说明此多肽合成酶可以直接识别 D-Ala。本课题组在研究中也发现，多粘类芽孢杆菌SC2的菌落分化现象突出，并伴随着杀镰刀菌素分泌量的变化，但尚不清楚多粘类芽孢杆菌的分化机制，其与脂肽类抗生素合成的相互关系也有待于进一步验证[17]。

4 多粘类芽孢杆菌的脂肽类抗生素分泌机制 多粘类芽孢杆菌胞内合成脂肽类抗生素后需要尽快排出，否则会对细胞自身造成一定损伤。多粘类芽孢杆菌属于革兰氏阳性细菌，革兰氏阳性细菌普遍含有的外排途径有Sec分泌途径、Tat分泌途径、ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）分泌途径以及其它特殊途径[37，38]。

多粘类芽孢杆菌中脂肽类抗生素外排蛋白的研究中，敲除两个ABC型转运蛋白基因pmxC或pmxD，可显著降低多粘类芽孢杆菌PKB1对多粘菌素以及杀镰孢菌素的分泌量，pmxC比pmxD作用更显著[13]，即证实了ABC型转运蛋白对脂肽类抗生素分泌的重要作用，以及分泌过程的非专一性。本课题组对辣椒根际互作培养的多粘类芽孢杆菌SC2（可高产多粘菌素）的转录组测试，以及一株经ARTP诱变获得的不产多粘菌素的突变株的转录组测序结果进行比较后发现，大量ABC型转运蛋白的表达差异显著，并和多粘菌素产量有很强的相关性，并且ABC型外排蛋白对多粘菌素的分泌起到了重要作用。在革兰氏阳性细菌中，ABC型转运蛋白是分泌抗菌肽的重要膜蛋白[37]，外排型ABC转运蛋白包括两个疏水的跨膜结构域（TMD）和两个亲水的核苷酸结合域（NBD）（图3）；一般一个基因同时编码有一个TMD和一个NBD，组合成同型二聚体形式的完整ABC外排蛋白；若两个不同基因编码的TMD和NBD组合，可组成异型二聚体型ABC外排蛋白[38]。我们推测，pmx基因簇中的两个ABC分泌蛋白pmxC和pmxD组合成异型二聚体。TMDs构成跨膜孔道，通过改变构象识别和输送底物，序列变异较大；而NBDs含有高度保守的序列，可定位在细胞质膜表面，通过水解ATP提供能量行使转运[37]。ABC转运蛋白分泌途径除了可转运抗菌肽类物质，还可转运氨基酸、多糖等多种物质。虽然多粘类芽孢杆菌中脂肽类抗生素ABC外排蛋白的结构尚未解析，但通过近缘ABC外排蛋白的晶体结构[38]可推测其结构，为研究多粘菌素的外排转运机制提供结构基础。目前，对革兰氏阴性病原菌的多粘菌素耐药机制研究较多，外排蛋白对多粘菌素的外排作用是机制之一，如外派泵AcrAB和KpnEF在克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）的多粘菌素抗性方面具有重要作用[39]。一些针对外排转运蛋白的氨基酸突变工作，可以识别转运关键位点，同时也有助于增强分泌能力，揭示重要分泌机制[40]，多粘菌素的跨膜分泌机制需要进一步揭示。

5 总结与展望

近年来，多粘类芽孢杆菌除了在医学上广泛使用之外，作为拮抗细菌的筛选研究工作在国内外也已取得较大进展，是生产生物农药和生物肥料的重要菌种。其重要的生物活性成分多粘菌素和杀镰刀菌素等脂肽类抗生素的基因簇鉴定、分子结构解析、合成调控过程以及分泌途径的研究，有助于增强多粘类芽孢杆菌的脂肽类抗生素合成和分泌能力，增强菌株应用效果，为开展代谢工程与合成生物学研究及构建高效工程菌株奠定基础。目前，多粘类芽孢杆菌的脂肽类抗生素的合成调控机制尚未完全解析，如精确起始转录的调控因子有哪些？它们之间是如何协作的？与初级代谢合成的转换开关是什么？合成后与跨膜分泌途径的识别和动力机制更有待于进一步深入开展。尤其尚需深入鉴定多粘类芽孢杆菌分泌脂肽类抗生素的ABC转运蛋白系统。同时，是否存在其他高效率的非特异性ABC外排蛋白？识别和转运多粘菌素过程中，ABC外排蛋白的哪些功能位点在起作用？另外，在多粘类芽孢杆菌和病原菌以及不同作物的互作过程中，感知外界信号的基因以及开启脂肽类抗生素大量合成的基因通路有待于进一步揭示。

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