一株基因10型Ⅰ类新城疫病毒P基因的遗传进化分析

杨少华 黄艳艳 张琳 黄庆华 崔宁 张秀美 许传田

摘要：为探讨新城疫病毒（NDV） P基因及其编码蛋白的遗传进化特性，了解野鸟源NDV的基因变异情况，本研究对我国首次分离的野鸟源Ⅰ类NDV分离株SD18/13的P基因进行了测序，并从GenBank中选取不同基因型毒株的P基因序列进行遗传进化分析。结果表明，SD18/13 P基因开放阅读框全长1 200 bp，编码399个氨基酸，与Ⅰ类NDV的氨基酸同源性为83.5%～98.5%，与Ⅱ类NDV的氨基酸同源性为67.2%～70.5%。SD18/13与法国分离株Teal/France/10010/2010聚于一簇，同属于基因10型Ⅰ类NDV，两者P基因的核苷酸同源性为98.2%，氨基酸同源性为98.5%。

关键词：新城疫病毒；P基因；克隆测序

中图分类号：S852.65+7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0126-04

Abstract In order to investigate the genetic evolution characteristics and its encoded protein of phosphoprotein （P） gene of Newcastle disease virus （NDV）， and to understand the genetic variation of NDV in wild birds， the P gene of SD18/13 firstly isolated from wild type bird NDV in China was sequenced. The P gene sequences of different genotypes were selected from GenBank， and genetic evolution analysis was carried out. The results showed that P gene of SD18/13 was 1 200 bp in length and contained an opening reading frame coding 399 amino acids. P gene of SD18/13 share 83.5%～98.5% amino acid homology with Class Ⅰ NDV， and 67.2%～70.5% amino acid homology with Class Ⅱ NDV. SD18/13 was clustered into sub-genotype 10 in Class Ⅰ NDV， and showed high similarity with French isolate Teal/France/10010/2010. The nucleotide homology of the P gene between SD18/13 and Teal/France/10010/2010 was 98.2% and the amino acid homology was 98.5%.

Keywords Newcastle disease virus （NDV）； P gene； Cloning and sequencing

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）引起的严重危害世界养禽业的传染病病原之一[1]，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的传染病，我国农业部将其列为一类动物疫病。NDV在分类上属于副粘病毒科副粘病毒亚科禽腮腺炎病毒属，为有囊膜、单股负链RNA病毒[2]，其基因组全长约15.2 kb，编码6种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L），以3′-NP-P-M-F-HN-L-5′的顺序排列[3]。NDV只有一个血清型，但是可以分为不同的基因型，根据遗传进化特性可将新城疫病毒分为2类，即Ⅰ类（ClassⅠ）和Ⅱ类（ClassⅡ），Ⅰ类新城疫病毒多为弱毒株，可分为1～10种基因型，Ⅱ类新城疫病毒可分为Ⅰ～ Ⅸ基因型[4，5]。NDV宿主非常广泛，可感染多种鸟类和野生水禽，水禽是NDV的天然贮存宿主[6-8]。

P蛋白位于核衣壳内，与L和NP蛋白形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein， RNP）复合物， 参与病毒的复制和转录。P蛋白是决定NDV毒力强弱和免疫原性的主要因子，在NDV种属分类、基因进化及毒力因素方面也起到重要作用[9]。本研究对我国首次分离的基因10型Ⅰ类NDV分离株的P基因进行克隆和遗传进化分析，并与国内外一些代表性毒株进行同源性比对分析，以探讨国内外不同基因型P基因的差异，了解NDV基因的演化规律，以期为NDV的免疫预防提供一定的理论依据。

1 材料與方法

1.1 病毒株

2013年本实验室在NDV流行病学调查中从白鹭上分离鉴定并保存的毒株，为基因10型Ⅰ类NDV分离株SD18/13[10]。

1.2 主要试剂

一步法RT-PCR试剂盒、胶回收试剂盒购自大连宝生物公司，Trizol 购自Invitrogen公司，T载体、DH5α感受态细胞购自北京全氏金公司。

1.3 P基因的克隆测序

利用Primer 5.0设计引物，P1：5′-ACGACACCGATTGGGGCT-3′，P2：5′-GTATGTGGTGATGAACACTGAG-3′，扩增片段为1.9 kb。Trizol法提取病毒RNA，按照试剂盒说明，采用一步法RT-PCR进行P基因的扩增。PCR反应体系为100 μL，包括：反应缓冲液10 μL ，MgCl2 （25 mmol）20 μL，dNTP（各10 mmol/L） 10 μL，AMV RTase 2 μL，AMV-Optimize Taq （5 U/μL）2 μL ，RNA酶抑制剂（5 U/μL）2 μL ，上下游引物（20 μmol）各2 μL ，RNA模板8 μL ，RNase free H2O补至100 μL 。PCR反应条件为：50℃ 15 min，94℃ 2 min；然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共30个循环；72℃ 10 min；4℃保存。PCR产物纯化后插入T载体转化感受态细胞，鉴定阳性质粒送上海生工生物工程公司测序。

1.4 P基因序列比對及遗传进化分析

从GenBank选取NDV代表性毒株的序列，用DNAStar软件对SD18/13和参考株P基因序列及其编码的氨基酸序列进行比对和同源性比较，利用遗传进化分析软件MEGA 4.1以Neighbor-joining方法构建新城疫病毒P基因系统进化树，其中Bootstrap设置为1 000次重复。

2 结果与分析

2.1 P基因的扩增与测序

RT-PCR扩增产物约1.9 kb，与预期片段长度相符，测序发现SD18/13 P基因全长1 463 nt，ORF长度1 200 bp，编码399个氨基酸。

2.2 P基因序列比对和遗传进化分析

通过与GenBank中参考株序列比对，SD18/13 P基因与Class Ⅱ NDV的核苷酸同源性为63.9%～65.5%，氨基酸同源性为67.2%～70.5%，其中与疫苗株LaSota的氨基酸同源性为70.2%；与国内强毒株F48E8的氨基酸同源性为70.5%；SD18/13 P基因与ClassⅠ毒株的核苷酸同源性为83.2%～98.2%，氨基酸同源性为83.5%～98.5%。利用MEGA 4.1软件对P基因进行系统进化分析（图1），结果表明，SD18/13 P基因与分离株Teal/France/10010/2010聚于一簇，同属于ClassⅠ基因10型毒株，这与利用F基因进行遗传进化分析的结果相符（图略）。

2.3 P蛋白氨基酸变异位点分析

将SD18/13及参考株P蛋白氨基酸序列进行比对，发现SD18/13 P蛋白氨基酸残基变异位点较多，且某些位点的氨基酸是不同群不同基因型NDV所特有的。其中，ClassⅠ和ClassⅡ群特异性位点有34个；基因10型NDV的P蛋白存在数个区别于ClassⅠ其他基因型NDV的特征性氨基酸位点，如：G61A、S126N、H176P、P222Q等；而位点P299L、V342I、G372S是分离株SD18/13所特有的，与其他ClassⅠ和ClassⅡ参考毒株均不同（表1）。

3 讨论与结论

P蛋白因丝氨酸和苏氨酸含量较高，常作为磷酸化位点被宿主细胞内蛋白激酶激活而发生磷酸化，故称之为磷蛋白，P蛋白磷酸化在病毒RNA的合成中发挥重要作用[11]。P蛋白与L蛋白结合形成病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），再与NP蛋白包裹的RNA特异性结合，形成RNP复合物，继而启动病毒的复制。除此之外，P蛋白可阻止NP蛋白的“非法”衣壳化[12]。P蛋白上主要的功能区结构域分别为：P-N蛋白结合区、P-P蛋白相互作用区、P-L蛋白的结合区。P-N蛋白结合区，位于P蛋白的N端（PNT），P-P蛋白相互作用区和P-L蛋白的结合区位于P蛋白的C端[13，14]。P蛋白N端1～59位氨基酸和C端316～347位氨基酸能形成超螺旋结构，是P蛋白与L和NP蛋白以及自身蛋白之间相互作用的主要区域[15]。

NDV P蛋白基因有1 451 bp和1 463 bp两种核苷酸形式，分别编码395、399个氨基酸，主要区别是Ⅰ类NDV的P基因在非编码区插入了12 bp。SD18/13是2013年分离的基因10型Ⅰ类NDV ，P基因开放阅读框全长1 200 bp，编码399个氨基酸，与Ⅰ类NDV的氨基酸同源性为83.5%～98.5%，与Ⅱ类NDV的氨基酸同源性为67.2%～70.5%。SD18/13与法国分离株Teal/France/10010/2010聚于一簇，同属于基因10型Ⅰ类NDV，两者P基因的核苷酸同源性为98.2%，氨基酸同源性为98.5%。SD18/13虽然是Ⅰ类NDV，但与其他基因型Ⅰ类NDV毒株存在明显的不同。通过P蛋白氨基酸序列比对也能发现这一差异，如P299L、V342I、G372S是分离株SD18/13所特有的氨基酸位点，这些位点位于P蛋白的C端部分（PCT），具体作用有待于进一步研究。整个P蛋白中绝大多数的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点都位于P蛋白的N端部分（PNT），通过序列比对发现这些位点的氨基酸残基是比较保守的。

参 考 文 献：

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