平板培养结合宏测序法调查小麦田土壤真菌多样性

马乐乐 翟妮平 马庆周 郭玉霞 耿月华 张猛

摘要：从河南省商丘市小麦田里于扬花期采集土样3份，通过ITS2宏测序方法结合平板培养法研究了小麦扬花期田间真菌种类，发现小麦田块物种多样性指数明显大于甜瓜地块，平均有1 630个OTUS。培养法获得的主要菌株为枝细枝孢（Cladosporium ramotenellum）、疣孢漆斑霉（Myrothecium verrucaria）和链格孢（Alternaria alternata），并对其形态进行详尽的描述。

关键词：土壤真菌；宏测序；枝细枝孢；疣孢漆斑霉；链格孢

中图分类号：S154.38 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0119-04

Abstract Three soil samples were collected from wheat fields in Shangqiu City of Henan Province. The fungal species at the flowering stage of wheat were studies by ITS2 macro sequencing combined with plate culture method. The results showed that the species diversity index of wheat field was significantly greater than that of melon plots， for an average of 1 630 OTUS. The main strains obtained by culture were Cladosporium ramotenellum，Myrothecium verrucaria and Alternaria alternata， and their morphology was described in detail.

Keywords Soil fungi； Macro sequencing； Cladosporium ramotenellum； Myrothecium verrucaria； Alternaria alternata

河南是小麦种植大省，气候处于亞热带温带过渡带，四季分明，气候非常适合小麦生长，同时建有国家粮库，在国家粮食安全上起着举足轻重的作用。现在的主要种植制度为小麦和玉米轮作，这种轮作方式在土地利用上发挥了很好的时间优势[1]。其中秸秆还田是该种植制度下的主要耕作方式，并且有诸多好处[2-5]。秸秆尤其玉米秸秆还田后长期不腐烂现象造成了很多病原菌的积累。土壤中的微生物是秸秆降解的主要参与者，但冬小麦和夏玉米轮作体系下的土壤丝孢真菌物种多样性至今未有系统报道，本研究通过宏条形码技术结合平板培养法对冬小麦和夏玉米轮作体系下土壤真菌的多样性进行研究。

1 材料与方法

2017年4月在河南省商丘市采集多年小麦玉米轮作田块土样3份，编号为SQ425-1、SQ-2、SQ-3，另外采集一份甜瓜田块土样ZKG-1做对照，进行室内分离培养和ITS2宏测序分析。

可培养丝孢菌的研究方法：采用TWA稀释平板法处理土壤样品标本，然后进行单孢分离获取目的菌株，进行菌株保存和鉴定描述，详细方法见参考文献[6]。

免培养法研究菌种多样性：采用试剂盒（MP Biomedicals， Solon， OH， USA）法提取土壤总DNA。用引物ITS3F （5′-GCATCGATGAAGAAC

GCAGC-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGA

TATGC-3′） 扩增ITS2片段。PCR反应体系为：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补至25 μL。PCR反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 7 min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂凝胶电泳检测，所得产物经PCR产物纯化试剂盒进行回收，送至上海生工生物技术有限公司进行测序，利用数据库FLASH、QIIME、UNITE和INSDC分析土壤中真菌物种多样性。

2 结果与分析

2.1 宏测序结果

通过 ITS3F和ITS4引物对ITS2进行宏测序，获得序列片段大小约320 bp，小麦土壤样品（SQ425-1、SQ-2、SQ-3）序列分别为57 861、55 367条和49 624条，平均54 284条，获取的OTUS分别为1 824、1 380个和1 688个，平均为1 630个，对照组瓜田（ZKG-1）OTUS为1 273个（表1）。小麦田中的Shannon指数明显大于瓜田且三块小麦田的重复性较好，可见瓜田的物种多样性指数明显低于小麦田块，同时小麦田的Simpson指数远远小于瓜田土壤，同样反映了小麦田块真菌的物种多样性指数明显较高。

通过样品的OTUS聚类树（图1）可见，三个小麦重复样品能很好地与瓜田土样分开。在宏测序中获得较多的OTUS为未分类群（unclassified），说明大多数宏测序得到的结果未能在数据库匹配上具体的物种。获得较多的菌种有镰刀菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）、青霉属（Penicillium）、腐质霉属（Humicola）和尾孢属（Cercozoa），但是没有检测到漆斑霉（Myrothecium）。通过韦恩图（图2）可以看出，4份土样中都有的OTUS有79个，而瓜田特有的有1 040个。

2.2 可培养真菌的形态学观察

获得的可培养真菌主要是枝细枝孢、疣孢漆斑霉和链格孢。

枝细枝孢在PDA培养基上菌落平展，绒状，暗绿色。培养两周后菌落直径3 cm。菌丝近无色至淡褐色，有隔膜，光滑或密布小疣，偶分枝菌丝宽1.5～3.5 μm。分生孢子梗单生且间生或顶生于菌丝上，无色或淡褐色细线或阔线型，偶有分枝，直或者弯曲，不呈屈膝或“Z”字形弯曲（图3）。产孢细胞顶生或侧生，圆柱形。分生孢子间生或顶生，孢子链分枝；顶生的小孢子为单生球形或卵球形，大小3～5.5 μm×2～3 μm；间生的分生孢子圆柱形或椭圆形，无隔膜或一个隔膜，大小4～14 μm×3～4 μm；次级枝孢为圆柱形，0～2个隔膜，分隔处孢脐明显。

疣孢漆斑霉菌落平整，初白色，后渐变为灰色，呈绒毛状或疏松棉絮状。生长速度中等，25℃PDA培养基上培养14 d菌落直径达3 ～ 8.5 cm，培养基背面淡褐色或灰白色。菌丝体部分表生，部分埋生。菌丝光滑，有隔膜，无色或淡褐色，分枝，有时形成菌丝束，宽1.5～3 μm。产孢梗为单线形，具隔膜，端部分枝多呈青霉状排列，近无色。产孢瓶体光滑，淡橄榄褐色，顶端明显乳头状突出，无隔膜，大小4.5～21 μm×1.5～3 μm。分生孢子舟形、柠檬形，两端尖细，基部半截，有时可见1～2个油滴，淡褐色，聚集在一起常为中等褐色或绿色，大小5.5～7.5 μm×2～3 μm（图4）。

链格孢菌落平整，棉絮状或绒状，常为灰色及灰褐色，等径生长，速度中等，在25℃环境下PCA培养基上培养14 d菌落直径达3～6.5 cm。菌丝体淡褐色或无色，表生或埋生，有隔膜且常有分枝。分生孢子梗单生或簇生，直立或膝状折曲（图5）。分生孢子（孔出孢子）倒棍棒形、椭圆形，多胞，具有横纵膈膜，暗色，链生或单生，孢子大小12～41 μm×7～14 μm，喙胞短或长，长喙有的一次分枝，具隔膜，浅色或无色。

3 讨论与结论

宏条形码技术是基于1998年Handelsman提出宏基因组学的方法而快速发展起来的新技术[7]，可以快速高效检测土壤中的微生物动态变化，也是真菌检测方面常用的免培养方法。2011年，Mendes等[8]基于微矩阵芯片的宏条形码技术和可培养功能分析方法研究了抑病土壤的根际微生物群落，发现变形菌门、厚壁菌门和放线菌门与疾病的抑制有关。2014年，Tedersoo等[9]获取了全球365个土壤样品的真菌ITS序列，发现气候因子對土壤真菌的物种丰富度和群落组成影响最大，并直接或间接通过土壤和植物等因素的变化影响土壤真菌多样性。现在真菌宏条形码技术一般通过ITS2片段测序进行分析。本研究通过培养计数方法发现排在前三名的真菌为枝细枝孢、疣孢漆斑霉和链格孢，均为腐生性，容易在培养基上生长。不过链格孢是很多叶斑病的病原菌，更多情况是在病害发生后期复合侵染[10-12]。

对于小麦常见重要病原菌的测定，宏测序结果不太理想，有少量的镰刀菌，但是没有Bipolaris菌种，而前人在该时期小麦土壤中发现较多的Bipolaris菌。镰刀菌是重要的小麦病原菌，尤其赤霉病危害严重[13-16]，但是在ITS2的宏测序中并没有发现这个特点，可能是由于目的片段太短，所以不能确定到种。本方法中能够获得两属的部分菌株，但生长量不多。ITS是重要的真菌分子鉴定条形码，通过宏测序ITS1或者ITS2，得到300 bp左右的片段，在鉴定上很难达到物种水平。这两个方法暂时很难统一起来，所具有的数据也不在一个数量级别，以后还要在宏测序上继续扩大测序片段以求鉴定到种的级别。

小麦是我国重要的粮食作物，目前尚未有对其土壤真菌物种资源多样性的系统研究，而对其资源的挖掘将为病害绿色防控、秸秆降解奠定重要资源基础。

参 考 文 献：

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