极细链格孢菌剂的初步研制及其除草作用研究

朱海霞 马永强 郭青云

摘要

本研究选用一株具有除草活性的生防菌株极细链格孢Alternaria tenuissima HZ-1作为研究对象，通过载体和助剂的筛选，初步研制出可湿性粉剂，并对杂草离体叶片、盆栽杂草及田间小区杂草的致病效果进行了测定。结果表明，HZ-1最适载体为高岭土，助剂为羧甲基纤维素、可溶性淀粉和白炭黑，菌株HZ-1可湿性粉剂对不同杂草离体叶片致病性表现为：密花香薷>冬葵>野燕麦>薄蒴草>酸模叶蓼>藜>萹蓄。盆栽致病性结果显示，HZ-1可湿性粉剂对薄蒴草、藜和密花香薷致病效果突出，对冬葵和酸模叶蓼次之，对萹蓄、野燕麦无效。小区试验显示对繁缕、藜和密花香薷有显著除草效果。该菌株可作为防除薄蒴草、藜、密花香薷和繁缕等杂草的生物除草剂进行进一步研究。

关键词

极细链格孢菌HZ-1; 菌剂研制; 除草效果

中图分类号：

S 432， S 482.4

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018177

Development of the biocontrol agents of Alternaria tenuissima

HZ-1 and its herbicidal activity

ZHU Haixia， MA Yongqiang， GUO Qingyun

（Academy of Agriculture and Forestry Sciences of Qinghai University， State Key Laboratory of Plateau Ecology and

Agriculture of Qinghai University， Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining， Ministry of

Agriculture， Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province， Xining 810016， China）

Abstract

Alternaria tenuissima HZ-1 was selected as a high virulent strain to weeds. Proper carrier and auxiliary were screened and wettable powder was developed as biological herbicide， and the virulence to different weeds in vitro and in vivo was also determined. The results showed that the optimal vector of HZ-1 was kaolin， the auxiliarges were carboxymethyl cellulose， soluble starch and silica. The susceptibility of strain HZ-1 wet powder to different weeds in vitro was as follows： Elsholtzia densa Benth.>Malva verticillata L.var. crispa>Avena fatua L>Lepyrodiclis holosteoides （C.A.Mey.） Fisch.et Mey.>Polygonum lapathifolium L.>Chenopodium album L.>Polygonum aviculare L.. Pot experiments showed that wet powder of HZ-1 had significant virulence to L. holosteoides， C. album and E. densa， but no virulence to P. aviculare and A. fatua. Field trials demonstrated that wet powder of HZ-1 was highly virulent to Stellaria media， C. album and E. densa. This strain could be further studied as a biological herbicide to control L. holosteoides， C. album， E. densa and Stellaria media.

Key words

Alternaria tenuissima HZ-1; development of agent; control effect to weeds

當今，农田杂草控制还是以化学除草剂为主体[1]。随着农业现代化水平的提高，全球范围内的除草剂使用量将继续增加，因此，市场需求开始面向广谱、高效、低毒的新型除草剂的研制。微生物除草剂可有效替代部分高毒化学农药，减轻农业生产中长期和大量依赖化学除草剂施用所造成的能源和环境问题。目前，发展生物除草技术已逐渐成为全球的共识[1-2]。极细链格孢HZ-1是从青海省独特的生态条件下筛选出的具有除草活性的生防菌，前期研究发现该菌株对藜Chenopodium album、冬葵Malva verticillata var. crispa、酸模叶蓼Polygonum lapathifolium等杂草表现出不同程度的致病作用，安全性评价结果显示，该菌株除对春油菜有轻微影响外，对春小麦、蚕豆、豌豆和青稞4种作物相对安全，可作为防除藜、酸模叶蓼等阔叶杂草生物除草剂的候选菌株[3]。

由于微生物除草剂药效受外界环境影响很大，选择合适的剂型及载体助剂保持菌剂的稳定性和侵染活力至关重要[4-7]。鉴于此，本研究以极细链格孢HZ-1作为研究对象，通过载体及助剂配方筛选，研制了HZ-1可湿性粉剂，并测定了其对杂草的离体及活体毒力作用，旨在为加快HZ-1制剂的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试载体和助剂

载体：高岭土、硅藻土、拉开粉、石灰石、炉渣、沙子、黏土;稳定剂：膨润土、轻质碳酸钙、白炭黑;润湿剂：SDS、拉开粉;分散剂：羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、SDS、吐温、木质素磺酸钠;保护剂：腐殖酸、糊精、海藻酸钠、可溶性淀粉。

1.2 载体和助剂的筛选

将高岭土、硅藻土、沙子、黏土、聚乙烯醇、SDS、吐温、拉开粉和羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、膨润土、轻质碳酸钙、可溶性淀粉等载体和助剂，分别按2%的比例加入PDA培养基。将8 mm的菌饼置于含不同载体或助剂的培养基中，观察不同载体及助剂对菌株生长的影响。

1.3 菌株HZ-1可湿性粉剂制备

将4℃斜面保藏的菌株HZ-1进行液体培养作为种子液，以麦麸为发酵基质，葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，在25℃培养条件下固体培养9 d。获得的固体发酵物烘干粉碎，制成菌粉。

将HZ-1菌粉与筛选出的适宜载体、助剂，按照50%载体、5%保护剂、6%分散剂、1%稳定剂和3%润湿剂的比例混合，将样品初步磨细、混匀，然后于小型高速粉碎机中粉碎，制成可湿性粉剂[4]。

1.4 HZ-1可湿性粉剂对杂草的防除效果

1.4.1 HZ-1可湿性粉剂对杂草离体叶片的致病性

采集新鲜的杂草叶片，叶表用无菌水清洗后自然晾干，将叶片正放于垫有无菌滤纸和竹签的培养皿中，加无菌水使滤纸浸湿;制备的HZ-1可湿性粉剂有效活菌数约为1.0×1010mfu/g（mycelial fragment unit）（下同），将可湿性粉剂溶解，进行离体叶片接种试验，以只接种清水的叶片为对照，每处理重复3次。置于25℃光照培养箱中保湿培养，观察叶片发病情况。供试杂草叶片为：薄蒴草Lepyrodiclis holosteoides（C.A.Mey.）Fisch.et Mey.、藜Chenopodium album L.、野燕麦Avena fatua L.、萹蓄Polygonum aviculare L.、密花香薷Elsholtzia densa Benth.、酸模叶蓼Polygonum lapathifolium L.、冬葵Malva verticillata L.var. crispa L.。

1.4.2 HZ-1可濕性粉剂对盆栽及田间小区杂草的致病效果

将田间生长至7～12叶期，叶色正常的薄蒴草、藜、密花香薷、冬葵、酸模叶蓼、萹蓄、野燕麦移栽于花盆（d=15 cm）中，于实验室内培养;将HZ-1可湿性粉剂溶解后喷雾接种到移栽的健康杂草植株上。以接种清水的植株作为空白对照，设3次重复。接种后的杂草植株置于室温，7 d后调查杂草发病程度，称鲜重，计算发病率、鲜重防效，所有数据采用DPS统计软件进行差异显著性分析。同时将HZ-1可湿性粉剂溶解后喷雾接种到4～6叶期田间小区杂草藜、密花香薷、灰绿藜Chenopodium glaucum L.和繁缕Stellaria media （L.） Cyr.植株上，试验小区面积0.18 m2，每个处理重复3次，观察其控制效果，7 d后调查杂草发病程度，计算发病率、鲜重防效。

发病率=发病株数/总株数×100%;

鲜重防效=（对照杂草鲜重-处理残存杂草鲜重）/对照杂草鲜重×100%。

2 结果与分析

2.1 载体和助剂筛选

将所有载体和助剂按照2%的比例分别加入PDA培养基中，接入直径8 mm的菌饼进行平板培养，测量菌落直径和菌落数。菌株HZ-1在含不同载体或助剂的培养基上菌落直径和菌落lgcfu见表1。可以看出，HZ-1在各种载体及助剂上生长状态总体较好，且多数相差不大，综合原料成本选择高岭土、羧甲基纤维素、可溶性淀粉和白炭黑作为HZ-1的载体和助剂进行后续试验。

2.2 菌株HZ-1可湿性粉剂制备

以高岭土作为载体，羧甲基纤维素作为分散剂，可溶性淀粉作为保护剂，结合适量的白炭黑作为稳定剂，进行可湿性粉剂的制备。虽然拉开粉对菌落生长没有起到促进作用（表1），但在农药可湿性粉剂配制过程中，它不仅可以保证产品遇水时能够被快速润湿，而且能协助分散剂与原药粒子迅速结合，因此，本试验中选用拉开粉作为润湿剂。

表1 HZ-1在含有不同载体和助剂的PDA培养基上菌落数量及直径

Table 1 Number and diameter of HZ-1 colonies on PDA media with different carrier and auxiliary

将HZ-1菌粉与筛选出的适宜载体、助剂，按照50%高岭土、5%可溶性淀粉、6%羧甲基纤维素、1%白炭黑和3%拉开粉的比例混合，将样品初步磨细、混匀，然后于小型高速粉碎机中粉碎，制成可湿性粉剂。

2.3 HZ-1可湿性粉剂对杂草离体叶片的致病性

菌株HZ-1可湿性粉剂溶解后，接种到薄蒴草、藜、野燕麦、萹蓄、密花香薷、酸模叶蓼、冬葵离体叶片上（图1），接种7 d 后，各种杂草叶片可见不同程度的病斑，并逐渐向四周扩展，酸模叶蓼、藜、萹蓄叶片失绿、发黄，卷曲;薄蒴草叶片黄化，褐色斑纹逐渐扩展;野燕麦、密花香薷和冬葵叶片变褐、开始发黑腐烂，叶片上出现大量白色菌丝，90%叶片腐烂坏死。菌株HZ-1可湿性粉剂对不同杂草离体叶片致病性表现为：密花香薷>冬葵>野燕麦>薄蒴草>酸模叶蓼>藜>萹蓄。

图1 HZ-1可湿性粉剂对不同杂草離体叶片的防效

Fig.1 Control effects of HZ-1 wettable powder on different weeds leaves in vitro

2.4 HZ-1可湿性粉剂对盆栽杂草防治效果

如图2所示，喷施菌株HZ-1可湿性粉剂后，除萹蓄和野燕麦外，其余5种杂草均表现出受害症状，不同程度地出现萎蔫，褪绿变黄，甚至枯萎。结合发病率、鲜重防效综合分析（表2），HZ-1可湿性粉剂对藜、薄蒴草和密花香薷致病效果突出，对冬葵和酸模叶蓼次之，对萹蓄和野燕麦无效。表2结果显示，接种后7 d，HZ-1可湿性粉剂对藜的发病率和鲜重防效分别为63.2%和59.0%，对薄蒴草和密花香薷的发病率和鲜重防效分别为55.1%、53.5%和55.7%、50.6%。因此，HZ-1可作为防除薄蒴草、藜和密花香薷等农田杂草的生物除草剂进行进一步研究。

图2 HZ-1可湿性粉剂对不同杂草的盆栽防效

Fig.2 Control effects of HZ-1 wettable powder on potted weed plants

表2 菌株HZ-1可湿性粉剂对不同杂草盆栽致病力1）

Table 2 Virulence of strain HZ-1 wettable powder to

different weeds in pot

1） 同列不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同。

Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level. The same below.

2.5 HZ-1可湿性粉剂对田间小区杂草的致病效果

如图3所示，喷施菌株HZ-1可湿性粉剂后，密花香薷、繁缕、灰绿藜、藜不同程度地出现受害症状。结合发病率、鲜重防效综合分析（表3），HZ-1可湿性粉剂对繁缕、藜致病效果突出，对密花香薷和灰绿藜次之。接种后7 d，HZ-1可湿性粉剂对繁缕的发病率和鲜重防效分别是95.4%和92.27%，对藜和密花香薷的发病率和鲜重防效分别是78.6%、73.91%和58.5%、47.53%。

表3 菌株HZ-1可湿性粉剂对田间小区杂草致病力

Table 3 Virulence of strain HZ-1 wettable powder to

weeds in plot fields

3 结论与讨论

微生物除草剂的开发应用比化学农药的开发存在更大的难度，其药效受外界环境影响很大，选择合适的剂型及载体助剂是生物农药开发成功与否的关键[8-11]。微生物制剂中的助剂性质决定菌剂的各项初始理化性质[12]，本研究以具有较强致病活性的生防菌株HZ-1作为研究对象，通过培养基皿内试验筛选法筛选出了HZ-1适合的载体为高岭土，分散剂为羧甲基纤维素，保护剂为可溶性淀粉，稳定剂为白炭黑。通过助剂配方的筛选，确保了制剂有效成分的生物活性。按照“农药制剂加工实验”[4]中可湿性粉剂的配制方法，将HZ-1菌粉与筛选出的载体、助剂按照50%高岭土、5%可溶性淀粉、6%羧甲基纤维素、1%白炭黑和3%拉开粉的比例混合、粉碎，初步制备了HZ-1可湿性粉剂。

图3 HZ-1可湿性粉剂对4种杂草的小区防效

Fig.3 Control effect of HZ-1 wettable powder on 4 species of weeds in plot fields

可湿性粉剂具有附着性强，漂移少，对环境污染轻，生产成本低，便于运输等特点，并可以使不溶于水的微生物加工成可兑水使用的农药制剂。本研究初步得到了菌株HZ-1可湿性粉剂配方，对于该菌剂的各项性能，包括流动性、润湿性、悬浮性、细度、稳定性能等指标，还需要进一步测定。

本研究利用初步研制出的可湿性粉剂，测定了其对杂草离体叶片的致病性以及对盆栽杂草和田间小区杂草的致病效果。该菌株对不同杂草离体叶片致病性表现为：密花香薷>冬葵>野燕麦>薄蒴草>酸模叶蓼>藜>萹蓄。盆栽试验中对薄蒴草、藜和密花香薷致病效果突出，小区试验中对繁缕、藜和密花香薷有显著除草效果。因此，该菌株可作为防除薄蒴草、藜、密花香薷和繁缕等杂草的生物除草剂进行进一步研究。同时，有望协调运用其他环境友好型防治技术，构建田间杂草生物防治技术体系，从而有效替代部分高毒化学农药，缓解和减轻农业生产中长期和大量依赖化学除草剂施用所造成的能源和环境问题。

杂草生防菌剂应具备对靶标杂草强致病力的同时，又得保证其稳定性[13]。由于微生物细胞本身的生理特性，不能有效解决生物细胞长期常温保存的技术瓶颈，使得发酵基质的固体剂型不能像化学除草剂一样长期贮藏，与化学除草剂相比处于劣势[14-16]。因此，未来还需探索出一种延长其货架寿命，提高对不良环境抵抗力的方法，例如加强不同微生物、微生物菌剂与减量除草剂复配的研究力度，为该菌株大田应用奠定更坚实的基础。

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（责任编辑： 杨明丽）