高通量测序技术在植物及昆虫病毒检测中的应用

战斌慧 周雪平

摘要

在过去的十几年中，测序技术的发展为分子生物学领域带来了革命性的变化。第二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术以快速、高灵敏性、高通量、非序列依赖性等特点极大地促进了病毒诊断学研究领域的发展。NGS技术可以在不了解病毒的生物学特性、血清学特点及基因组信息情况下快速检测未知病毒。通过对总核酸样本进行NGS可以获得某个特定生态环境或种植系统中的所有病毒序列，即病毒组。通过大量的NGS数据可以分析寄主中某一病毒的基因组变化、构建病毒的准种以及研究病毒的进化和起源。本文介绍了高通量测序的方法在植物和昆虫病毒检测中的应用。

关键词

第二代测序; 植物病毒; 昆虫病毒; 检测

中图分类号：

S 432.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018326

Application of next-generation sequencing technology in

detection of plant and insect viruses

ZHAN Binhui， ZHOU Xueping

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant

Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

In the past decade， the development of sequencing technology has induced revolutionary changes in molecular biology. Next-generation sequencing （NGS） has considerably promoted the development of research on viral diagnostics characterized by rapidity， high sensitivity， high throughput， sequence-independent， etc. NGS made it possible to rapidly detect unknown viruses without knowing the biological characteristics， serological characteristics， and genome information. The whole viral genomes in a particular ecosystem or cropping system， namely virome， could be sequenced through NGS of the total nucleic acids. Viral genome variability， reconstruction of quasispecies， evolution and origin within the host can be obtained by analyzing massive NGS data. In this article， we provide the overview of the process of NGS technology and its applications in detection of plant and insect viruses.

Key words

next-generation sequencing; plant virus; insect virus; detection

病毒是一种个体微小、结构简单，没有细胞结构的特殊生物，只能在活细胞内寄生并依赖宿主细胞实现增殖。它们种类繁多、数目庞大，是自然界中最为丰富和多样的生命体[1-2]。根据宿主的不同，可以将其分为植物病毒、动物病毒、真菌病毒等。其中，侵染植物及昆虫的病毒与农业生产密切相关。植物病毒素有植物癌症之称，其暴发和流行严重危害作物生长，威胁粮食生产。据不完全统计，全球每年因植物病毒病造成的损失约占粮食作物总产量的10%[3-4]。昆虫是农业生态系统的重要组成部分，其数目众多，占已知动物物种的70%以上。已知的昆虫病毒种类有1 000多种，然而，目前对昆虫病毒的研究主要集中在对有益昆虫病毒病进行防控以及利用昆虫病毒防治有害昆虫[5]。因而，对植物及昆虫病毒进行快速而有效的诊断、发掘新的病毒资源对于增强防控措施、保护农业生产安全具有重要意义。

传统的病毒检测方法主要有：生物学测定法、电子显微镜观察法[6]、以酶联免疫吸附反应为代表的血清学检测法[7]、基于核酸分析的PCR检测法[8]等。生物学测定法及电子显微镜观察法是最为经典的病毒检测技术，可用于病毒的初步检测。利用生物学测定法检测植物病毒时，主要依据病毒在指示植物上产生的症状进行诊断，诊断存在主观性;利用电子显微镜观察法可以直观地观察到病毒粒子的存在，但是要求病毒在寄主中具有较高的浓度，而且无法进行种的区分。在过去的几十年中，血清学方法及PCR技术为病毒诊断带来了突破性的研究成果，鉴定了大量病毒。然而，上述传统方法的应用均需对病毒的生物学特性、血清学特性、基因组结构、核酸序列等有预先了解，是针对某种或者某类病毒的特异性检测。在针对未知病毒开展的非特异性检测时，以上方法则缺乏优势，检测时间周期長，极大限制了对病毒病害的了解。第二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术克服以上传统检测方法的缺点，其所具有的非序列依赖性及高灵敏性为病毒诊断带来了重大的革新[5，9-10]。本文对高通量测序的方法及其在植物和昆虫病毒检测、资源发掘及进化中的应用作了系统介绍。

1 高通量测序技术

1977年，Sanger等利用双脱氧核苷酸末端终止法进行DNA测序，标志着第一代测序技术的诞生[11-12]。尽管第一代测序技术已经广泛应用于生命科学研究的各个领域，但由于其成本高、低通量、速度慢等缺点，无法高效解读所面临的海量生物信息。2005年，454公司（后被Roche收购）研发的高通量测序系统Genome Sequencer 2. 0 System标志着NGS技术的诞生，使得对遗传信息的分析进入了一个新的时代，具有里程碑式的意义。主流的测序平台有Roche公司的基于焦磷酸测序（pyrosequencing）原理的454/GS FLX测序平台、Illumina公司的基于合成法测序（sequencing by synthesis，SBS）原理的GAII/HiSeq平台及ABI公司的基于连接法测序（sequencing by ligation，SBL）原理的SOLiD平台[13]。由于测序原理的不同，每种测序平台各有其优缺点[5，9]。Roche的454/GS FLX测序平台具有最长的读长，可达700～1 000 bp，并且运行时间短，但是通量低，价格昂贵，并且在多聚物测量时具有较高的错误率;Illumina公司的GAII/HiSeq平台是目前应用最为广泛的测序平台，具有通量高、运行速度快、成本低等优点，具有最高的性价比，但是在读取复杂模板如高GC或高AT模板时，错误率较高;ABI公司的SOLiD平台是目前第二代测序技术中准确率最高的测序平台，在15倍覆盖率时测序准确度可达99.999%，但是读长短，仅有75 bp，且运行时间较长。经过十几年的发展，各种高通量测序平台也都在不断改进和发展。科研人员可以根据研究的需求不同，选择相应的测序平台。

2 利用NGS检测病毒的流程

除了在生物信息学、生物进化研究、群体遗传学等方面的应用外，NGS已被应用于病毒的鉴定、诊断及病毒资源的挖掘中。利用NGS技术检测病毒和发掘病毒资源的实验流程主要包括：样品制备、文库构建、平台测序、数据分析以及结果验证[5，14]。

2.1 样品制备及文库构建

样品的制备是NGS的关键步骤，它将直接影响文库的构建进而影响测序的深度。与寄主基因组相比，病毒基因组的含量相对较低。所以，除了利用总DNA或总RNA制备文库外，多种有利于提高病毒基因组核酸含量的样品制备方法被应用于病毒检测的实例中，如测序核酸采用去核糖体RNA的总RNA（ribosomal RNA depleted total RNA，rRNA-depleted totRNA）、双链RNA（dsRNA）、病毒粒子相关的核酸（virion associated nucleic acids，VANA）、多聚腺苷酸化的RNA（poly（A）RNA）及与健康植物抑制消减杂交后的RNA等（表1）。

表1 用于检测病毒的不同类型核酸样品

Table 1 Different types of nucleic acids for virus detection

病毒依据其核酸组成及其复制特征，可以被分为以下几类：双链DNA病毒，单链DNA病毒，双链RNA病毒，正义单链RNA病毒，负义单链RNA病毒[15]。在试验过程中应当根据病毒核酸的性质及其在侵染过程中的特点，选择不同的核酸样品进行文库制备和NGS测定。

dsRNA是RNA病毒在侵染循环过程中所产生的特有的形态，因此，利用dsRNA作为测序核酸可以高效地获得病毒的特异序列，提高测序的深度。Al-Rwahnih等[16]利用NGS检测引起西拉葡萄衰退症状的病毒时，分别提取了总RNA和dsRNA制备文库。测序结果表明，利用dsRNA构建的文库中病毒来源的reads数占总reads数的52.7%（54 605/103 597），而利用总RNA构建的文库中病毒来源的reads数仅占1.94%（1 275/65 587），说明通过提取dsRNA富集了较多的病毒dsRNA，提高了检测的灵敏性。数据分析发现共有沙地葡萄茎痘伴随病毒Grapevine rupestris stem pitting-associated virus （GRSPaV）、沙地葡萄叶脉羽化病毒Grapevine rupestris vein-feathering virus （GRVFV）等6个已知病毒及类病毒和一个新病毒西拉葡萄病毒1号Grapevine syrah virus-1 （GSyV-1）侵染西拉葡萄。另外，利用dsRNA作为检测病毒的核酸样品是检测真菌病毒的最主要方法。利用此方法可以有效地检测RNA病毒，但却不能有效地检测DNA病毒[17]。另外，雙链RNA的提取花费时间久，操作复杂。

利用VANA进行NGS测序是更为直接有效鉴定病毒的方法。近年来，利用此策略已经成功测定了多种植物及昆虫病毒。例如，Candresse等[18]利用454测序平台测定了命名为VARX和VSDA的两个甘蔗样品的VANA，除了已知的埃及甘蔗线条病毒Sugarcane streak Egypt virus （SSEV）外，还发现一种DNA病毒，命名为甘蔗白线条病毒Sugarcane white streak virus （SWSV）。数据分析表明，来源于SSEV的reads数在VARX和VSDA样品中分别占53.7%（1 398/2 612）和75%（1 227/1 635），覆盖整个SSEV基因组159倍和138倍;来源于SWSV的reads数在VARX和VSDA样品中分别占23.9%（625/2 612）和16.1%（264/1 635），覆盖整个基因组81倍和29倍。表明通过纯化VANA能够有效去除基因组的序列，达到最大化富集病毒核酸的目的。但是，对于无外壳蛋白包裹的病毒此方法则无法制备样品。另外，不同科属的病毒粒子提取方法差异较大，当样本中可能包含两种或几种病毒时，不能用同一种方法同时提取所有的病毒粒子。因而，在对检测样本了解较少的前提下，样品制备困难较大。

利用富集poly（A）RNA的方法制备样本，可以用于检测DNA和RNA病毒，但是不能检测没有poly（A）结构的病毒。Wylie和Jones[19]提取分离了水仙和朱顶红样品的poly（A）RNA，并以此为模板构建文库测序，检测到了麝香石竹潜隐病毒属和马铃薯Y病毒属的7个不同的病毒分离物。Wylie等[20]以相似的方法检测到分离自澳大利亚的百香果木质病毒Passion fruit woodiness virus （PWV），病毒的RNA占分离的poly（A）RNA的7.38%。

在植物病毒鉴定中，抑制消减杂交技术被用于样品的制备，Adams等[21]利用未感染病毒的cDNA对感病植物的cDNA进行消减杂交，并利用NGS鉴定到了黄瓜花叶病毒属的新病毒，名为蛇鞭菊轻斑驳病毒Gayfeather mild mottle virus （GMMV）。Monger等[22-23]也利用构建抑制消减文库的方式检测到了木薯褐条病毒Cassava brown streak virus （CBSV）和美人蕉黄条病毒Canna yellow streak virus （CaYSV）。但是，抑制消减文库的构建需要花费大量的时间，因而并不适合高通量样品的检测和病害诊断。

目前，总RNA测序适用于多种类型的病毒基因组，均能够检测DNA病毒及RNA病毒，并且样品制备相对简单，可被大部分的检测实验室使用。据统计，仅在2009至2014年间，就有30例利用总RNA构建的文库进行NGS测序检测植物病毒的实例被报道[17]，然而在检测较低滴度的病毒时有很大的不足。去除总RNA中含量丰富的rRNA，增加病毒RNA的相对含量则克服了以上缺点。研究表明，以rRNA-depleted totRNA构建文库能够使病毒RNA的相对含量提高10倍[24]。Liu等[25]利用感病的小麦和带毒的叶蝉样品分别构建rRNA-depleted totRNA文库，通过测序检测到一种新的经叶蝉传播的弹状病毒，名为小麦黄条纹病毒Wheat yellow striate virus （WYSV）。Xin等[26]通过分析感病西瓜样品的rRNA-depleted totRNA文库，检测到两种新的负义单链RNA病毒，并建议归属为布尼亚病毒目Bunyavirales白纤病毒科Phenuiviridae。

另外，小RNA（sRNA）测序也是鉴定病毒最常用的方法之一。自2009年，Donaire等[27]和Kreuze等[28]证明可以利用病毒来源的sRNA进行病毒基因组的组装以鉴定植物中的已知和未知病毒后，这一方法被广泛应用于未知病毒的鉴定。依据的原理是病毒的侵染会诱导寄主的RNA沉默机制发挥作用，产生病毒来源的sRNA。通过对寄主中sRNA的测序及分析可以鉴定寄主中的病毒种类。该种方法应用范围广，可以检测不同类型的DNA及RNA病毒[29]。迄今，应用该方法已成功检测30多种植物病毒[17]。但对于某些产生sRNA较少的持久性病毒或者潜隐性病毒，可能不能精确地组装病毒基因组。

2.2 平台检测及数据分析

在检测某种植物或昆虫病毒时，可根据侧重检测的病毒种类或已有的提示，提取或富集相应的核酸样本，根据检测需要，选取相应的测序平台获得高通量的测序数据。数据分析是利用NGS检测病毒的关键点和难点。以下以分析总RNA或rRNA-depleted totRNA测序数据为例，说明数据分析的过程[5]。第一步，原始数据处理，运用EMBOSS、CLC Genomic Workbench等软件去掉两端的接头、去掉低质量的数据等，获得clean reads。第二步，去掉基因组的数据（可选），若已知寄主的基因组数据库，可利用CLC Genomic Workbench等软件将获得的clean reads与参考基因组比对，筛选出不能比对到参照基因组的序列做进一步分析。第三步，将筛选的序列利用CLC Genomic Workbench进行从头拼接，然后将获得的片段（contigs）进行BLAST分析。第四步，对具有同源性的片段进一步组装，并比对NCBI核酸及蛋白数据库，揭示病毒的种类。

2.3 结果验证

根据获得的contigs，提取寄主的核酸，运用PCR、反转录PCR、cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）等技术验证病毒并扩增病毒基因组的全长序列。

3 NGS在植物及昆虫病毒检测及发掘中的应用

3.1 疑难杂症的病原诊断及新病毒的发现

基于NGS可应用于非特异性检测病毒的特点，很多农业生产中的疑难杂症可以利用NGS进行诊断。桑花叶型萎缩病是经济作物桑树上的重要病害，感病的植株较健康植株矮小，叶片花叶、卷曲，严重影响桑树的经济价值[30]。在长达数十年中，此病的病原未能明确，因而不能得到有效的防治。通过sRNA测序，从感病植株中检测到一种新的DNA病毒，研究表明该病毒与桑花叶型萎缩病具有极大地相关性，命名为桑花叶萎缩相关病毒Mulberry mosaic dwarf associated virus （MMDaV）[31]。我国是西瓜的主要生产国，种植面积及产量均居世界首位。病毒病害是限制西瓜产量的重要因素之一。2015-2016年，Xin等[26]在对河南开封的西瓜病害开展的田间调查中发现了表现花叶、卷曲症状的西瓜植株。利用总RNA测序及sRNA测序检测引起此病害的病毒，鑒定出了两种负义单链RNA病毒，命名为西瓜皱叶病毒1号Watermelon crinkle leaf-associated 1 （WCLaV-1）和西瓜皱叶病毒2号Watermelon crinkle leaf-associated 2 （WCLaV-2）。进一步的接种试验表明WCLaV-1能够引起与田间西瓜相似的皱叶症状。2013-2014年，Chen等[32]在云南和贵州省玉米病毒病的调查中发现表现典型的黄化、花叶症状的玉米植株。利用sRNA测序鉴定引起此病害的病毒，发现一种新的病毒，命名为玉米黄化花叶病毒Maize yellow mosaic virus （MaYMV）。2006-2007年，蜜蜂的蜂群崩溃失调病（colony collapse disorder， CCD）席卷美国的22个州，同时在法国、德国、澳大利亚等国也引起严重危害[33]。CCD的主要症状是大量的成年工蜂在短期内突然消失在蜂巢外，没有任何尸体，只有蜂王、卵、未成年工蜂残存在蜂巢中。为了探究CCD的病因，Cox-Foster等[34]从来自美国患CCD的蜂群和来自美国及澳大利亚的健康蜂群中提取总RNA构建文库测序，生物信息学分析从患CCD的蜂群中发现了7种病毒而从健康蜂群中发现了5种病毒。通过比对发现，以色列急性麻痹病毒Israeli acute paralysis virus （IAPV）与克什米尔蜜蜂病毒Kashmir bee virus （KBV）可能与CCD有关，通过进一步的研究确认IAPV与CCD的相关性最大。

近年来，通过NGS技术鉴定了很多不引起明显症状的潜隐性病毒，极大地丰富了病毒的资源。混合病毒科Amalgaviridae是由国际病毒分类委员会于2013年设立的一个新科，它由一类dsRNA病毒组成。因兼具整体病毒科Totiviridae和分体病毒科Partitiviridae的特征，故称为混合病毒科。此科包含4个确定种，其病毒粒子在侵染的植物组织中很难被纯化和观察到，并且并不能确定它们与寄主植物的某种症状具有相关性[35]。因而，发现此科病毒的侵染以及鉴定此科的病毒均具有很大的难度。然而，近两年由于生物信息学的快速发展，通过高通量的数据分析，发现和鉴定了很多之前未发现的病毒，极大地丰富了此科病毒的种类。例如，Nibert等[36]通过分析转录组数据，从12种不同的植物中筛选到19个包含混合病毒科病毒的序列。其中的16段序列包含预测混合病毒的全长编码区。Park等通过分析大叶藻[37]和菠菜[38]的转录组数据，鉴定了两种侵染大叶藻及一种侵染菠菜的混合病毒科病毒。

3.2 病毒组的鉴定

宏基因组学（metagenomics）是以测序为手段分析某个特定生态环境中整个微生物群体的基因组。在病毒学研究领域，基于NGS的宏基因组学分析使得研究某个特定生态系统或种植系统中的所有病毒成为可能。整个病毒的群体被称为病毒组（virome）。2009年，Roossinck等[39]发起了一个研究病毒生物多样性的调查。他们收集了10～20 g植物材料用于宏基因组测序。这些植物材料采集于美国俄克拉荷马州东北部的高草草原保护区（具有较低的植物多样性）和哥斯达黎加西北部关纳卡斯帝保护区（具有较高的植物多样性），涉及15个科400余个样品。生物信息学分析表明高达70%的样品中有病毒的同源序列，包括雀麦花叶病毒科、花椰菜花叶病毒科、分体病毒科、马铃薯Y病毒科等11个科的病毒，还包括一些未分类的病毒。2012年，Wylie等[40]从17种植物120个不同的植物叶片中提取总RNA并分离poly（A）RNA用于NGS分析。从中鉴定到20种带poly（A）RNA尾的RNA病毒，其中16个为已知病毒，4个为新病毒。2011年，Coetzee等[41]从南非的一个葡萄园中随机选取了44个葡萄藤蔓，从中分离dsRNA，构建文库并進行NGS。利用生物信息学方法构建病毒群体，包含4种已知的病毒及几种新病毒，其中葡萄卷叶伴随病毒3号Grapevine leafroll-associated virus 3 （GLRaV-3）为优势病毒，包含该病毒的reads数占总reads数的59%。

番茄是一种重要的经济作物，病毒病是限制番茄生产的主要因素。我国是番茄的主要生产国，为了研究番茄病毒在我国的分布特点，为番茄病毒病防治提供线索，Xu等[42]从我国主要番茄栽培区采集了170个疑似病毒侵染的番茄样品。通过sRNA测序及数据分析获得侵染我国番茄的病毒组，共检测到21种已知病毒、一个新发现的番茄病毒以及两种类病毒。病毒种类涉及12个属，其中正义单链RNA病毒是主要的群体。89%的样品为混合侵染，包含两种或三种病毒。通过分析病毒组还发现，在我国主要侵染番茄的病毒有番茄花叶病毒Tomato mosaic virus （ToMV）、番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）、马铃薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、南方番茄病毒Southern tomato virus （STV）等10种病毒。分析番茄病毒组可以检测到重组事件的发生率，黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus （CMV）和ToMV在正义-正义链重组和正义-负义链重组中均具有较高的重组率。另外，通过病毒组的分析还可以预测病毒的起源及进化等，利用各个地区TYLCV不同株系的基因组序列构建进化树，发现所有已经报道的来自中国的TYLCV株系在进化树中归于一支，表明其具有共同的起源;筛选56个代表株系，利用贝叶斯系统发育法分析其进化率，推测TYLCV可能早在1996年就已经在我国发生，早于2006年的首次报道。

3.3 病毒准种的构建

由于较高的突变和重组效率，病毒（特别是RNA病毒）是进化最快的生物之一。某一寄主中的病毒群体并不是单一的序列，而是包含很多不完全一致但是相似度极高的病毒基因组序列，称为病毒的准种（quasispecies）[43]。了解准种的遗传信息对于了解病毒的变异、进化、传播、毒性、躲避寄主的防御反应等均具有重要的意义。利用NGS构建病毒的准种、了解其群体变异主要集中在与人类疾病相关的病毒研究中，如登革病毒[44]、手足口病毒[45]、乙型肝炎病毒[46]等。近年来，利用NGS对植物和昆虫病毒准种的研究也取得了一些进展。Fabre等[47]利用NGS技术分析了4种具有不同替换位点及致病性特点的PVY变体在感病寄主辣椒中的种群动态，并结合数学模型描述了自然选择和遗传漂变在改变病毒的进化动力学中具有重要作用。Cornman等[48]通过NGS研究了侵染蜜蜂的蜜蜂畸翅病毒和IAPV的群体遗传变异，阐明不同区域不同样品间的单核苷酸多态性谱与侵染滴度和寄主种群数目具有相关性。Huang等[49]通过NGS分析和比对水稻条纹病毒Rice stripe virus （RSV）在自然寄主水稻和试验寄主本氏烟中的遗传多样性，发现在本氏烟中共有1 675处位点发生替换而在水稻中仅有341处，表明RSV在本氏烟中具有更高的遗传多样性，推测与寄主适应性相关。

4 优势和局限性

与传统的病毒检测方法相比，NGS的优势主要表现在以下几个方面。（a）NGS检测具有非序列依赖性，不需要依赖于病毒的序列特征或者生物学特征[14]。分析获得的NGS数据时，可以通过序列同源性或者非序列同源性两种方式来分析潜在的病毒序列。序列同源性的方式是基于未知病毒可能与已报道的病毒序列具有一定程度的同源性，进而推测获得的contigs可能包含与已知病毒具有同源性的新病毒[5];非序列同源性的方式则是采用逐渐过滤重叠sRNA的方式，发现与已知病毒序列完全不具有同源性的新病毒[50]。（b）NGS检测具有快速、灵敏性高的特点。利用传统检测方法检测未知病毒时，由于对病毒的序列及生物学特性了解甚少，所以检测花费的时间会非常长，甚至不能取得理想的检测结果。而NGS一般在几天内即可完成测序反应，数据分析及结果验证也可在较短时间内完成[51]。（c）NGS可以同时检测多种不同核酸类型的病毒。不论是DNA病毒或者RNA病毒均能够在一次总RNA或sRNA测序反应中被检测到[17]。实际应用中也可提取不同类型的核酸构建文库，以提高测序的准确性、灵敏性及广泛性[52]。（d）NGS可同时检测多个样本，样品检测具有高通量的特点。可将每个样品的cDNA带上特异性的序列，这样可同时检测来自于不同地区的不同种寄主中病毒的种类、分布以及变异进化等特征[39]。

NGS的局限性主要包括：（a）相較于Sanger测序而言，NGS的错误率相对较高且读长较短。（b）NGS需要科研人员掌握较高的生物信息学技术。NGS会产生海量的数据，如何对这些遗传信息进行筛选和分析，需要研究人员精通生物信息学分析方法。（c）目前NGS不能获得全长的基因组序列，特别是在5′端和3′端的非编码区，因而需要结合RACE-PCR等方法才能获得完整的病毒序列[5]。对于某些滴度比较低的病毒，在组装后仅能获得较短的contigs，需要与其他分子生物学试验结合才能确定病毒的存在。（d）通过NGS能够获得病毒的遗传信息，但是还需要掌握病毒的传播方式、寄主范围等生物学特性才能对新病毒进行分类以及证实病毒与某种疾病之间的相关性[14，51]。

5 结语

NGS的诞生为病毒学研究带来了新的方法，极大地推动了病毒学研究的发展。植物病毒和昆虫病毒与农业生产紧密相连，未来随着NGS的成本降低以及广泛推广，其将在病毒病快速诊断、病毒资源发掘、病毒组分析、准种构建等研究领域取得更为显著的成果，为农业的健康生产提供理论指导。以PacBio为代表的三代测序平台能够直接针对单个分子进行测序，具有准确率高、读长长、无GC偏好性等特点，但目前测序费用昂贵未能被广泛推广，期望未来该技术能够促进病毒学研究的发展。

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（责任编辑： 杨明丽）