白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影响

江 枫， 刘 丽， 张 公 亮,2， 侯 红 漫,2

( 1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 辽宁省水产品加工质量安全与控制重点实验室， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

群体感应是细菌细胞间信号传导和基因调控机制，能引起细菌致病性和食品腐败变质。因此，阻断细菌群体感应系统可以抑制群体感应控制的表型(例如：生物发光、生物膜形成、胞外酶合成)表达，控制食品的腐败。有研究表明，群体感应系统参与生物膜形成的所有阶段，调节种群密度和成熟的生物膜内的代谢活动，以适应营养需求和现有资源[1]。群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor，QSI)是指化学稳定的、高效的低分子质量分子，其对群体感应控制的表型显示出高度的特异性且没有毒性副作用[2]。

白藜芦醇是一种天然高效的抗生物膜活性制剂，Augustine等[3]首次报道亚抑菌浓度白藜芦醇能显著抑制V.cholerae生物被膜形成；Lee等[4]发现白藜芦醇能有效抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌生物膜形成。而白藜芦醇对水产品中优势腐败菌生物膜的影响报道较少。

蜂房哈夫尼菌在冷冻牛肉、鸡肉、生牛奶和鱼糜制品等食品腐败期间是一种主要的优势腐败细菌，在微生物食物腐败中起重要作用。前期工作已发现蜂房哈夫尼菌具有生物膜形成能力，本实验探究白藜芦醇对分离自即食海参的蜂房哈夫尼菌的抗生物膜活性，以期为进一步探究群体感应系统与生物膜的形成关系奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

结晶紫染色液，PBS，标准品C6-HSL，白藜芦醇，MH(B)培养基，卡那霉素；酶标仪。

1.2 方 法

1.2.1 培养基的配制

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L；pH (7.0±0.2)。STA琼脂培养基：胰蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂0.65%；pH (7.0±0.2)。Swimming培养基：蛋白胨1%，氯化钠0.25%，琼脂0.3%，均在121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 菌种的复苏

菌种：蜂房哈夫尼菌、紫色杆菌CV026。

将蜂房哈夫尼菌平板划线，30 ℃恒温培养16～18 h，挑取单菌落于100 mL新鲜LB液体培养基中，30 ℃振荡培养18～24 h，制备成种子液。

将紫色杆菌CV026接种于100 mL无菌LB培养基中，28 ℃、150 r/min摇床培养16 h，取1 mL 菌液转接至含20 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培养基中培养16～18 h。

1.2.3 最低抑菌浓度的测定

通过改良的微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度，分别检测白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌、紫色杆菌CV026的最低抑菌浓度(MIC)。

最低抑菌浓度：以在小孔内完全抑制细菌生长所需的最小药物浓度作为最低抑菌浓度。

1.2.4 报告菌平板法检测白藜芦醇及抑菌实验

按照报告菌平板法定性检测QSI[5]。

1.2.5 紫色杆菌素提取法定量检测白藜芦醇及抑菌试验

按照紫色杆菌素提取法定量检测QSI[6]。将CV026菌液、C6-HSL和不同浓度白藜芦醇分别混合后，加入96微孔板中。28 ℃培养48 h，将孔板水分烘干。向各孔中加入DMSO，摇床振荡2 h，使紫色杆菌素溶出，测定OD590。

抑菌实验时LB肉汤中不添加C6-HSL，其余过程同上，培养24 h，测定OD600。

1.2.6 白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影响

通过结晶紫染色法[7]测定白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影响。在96孔板中依次加入LB肉汤、不同浓度白藜芦醇和蜂房哈夫尼菌液，阳性对照孔不加白藜芦醇，30 ℃培养24 h后测定菌液OD600。去除孔板中的浮游细菌，用PBS洗涤，再用无水甲醇固定、结晶紫染色，加入冰醋酸溶解后测定OD590。通过生物膜成膜量评判标准判断其生物膜形成能力。

1.2.7 白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌游动能力的影响

在Swimming培养基中分别加入不同浓度白藜芦醇为实验组，以加生理盐水作为阳性对照[8]。取3 μL蜂房哈夫尼菌液点到平板中央，于30 ℃培养24 h，测定扩散圈直径。

2 结果与讨论

2.1 白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌的抑菌活性

如图1所示，经30 ℃培养24 h后，白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌的抑制活性随浓度增加而增强；在256 μg/mL时能完全抑制蜂房哈夫尼菌的生长(P<0.01)，因此白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌的最低抑菌浓度为256 μg/mL。

图1 白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌的抑制作用

2.2 白藜芦醇对CV026的抑菌活性

如图2所示，30 ℃恒温培养24 h后，随着质量浓度的增加，白藜芦醇对CV026抑制活性逐渐增强；当白藜芦醇质量浓度为128 μg/mL时，能完全抑制CV026的生长(P<0.01)。可见白藜芦醇对紫色杆菌CV026最低抑菌浓度为128 μg/mL，以下实验均在白藜芦醇的亚抑菌浓度下进行。

图2 白藜芦醇对CV026抑菌作用

2.3 CV026定性检测白藜芦醇抑制效果

CV026中紫色杆菌素的产生受群体感应系统的调控，若样品中含有群体感应抑制剂，将抑制CV026产生紫色，在小孔周围出现白色、浑浊且不透明的抑制圈。抑制圈的直径随浓度增加而增加，如图3所示。白藜芦醇产生了这种特异性的特征圈(图3(a))。对照组(图3(b))小孔周围没有产生抑菌圈，说明白藜芦醇可以干扰群体感应系统。从图3(a)中可知，特征圈直径随白藜芦醇浓度降低而减小。对溶剂DMSO进行检测，发现其未含有群体感应抑制剂作用和抑菌作用。

1～4，ρ=16，8，4，2 μg/mL；CK，二甲基亚砜

2.4 CV026定量检测白藜芦醇抑制效果

选择4种不同亚抑菌浓度进行实验，如图4所示。结果表明，与对照组相比，白藜芦醇在16 μg/mL 时显著抑制CV026产紫色杆菌素的能力(P<0.01)。随着白藜芦醇质量浓度的增大，其对紫色杆菌素产量的抑制率逐渐增大，抑制率从18.5%升高到74.9%。实验结果与Truchado等[9]的基本一致。为确定对紫色杆菌素产量的抑制并不是抑菌活性的作用，测定了白藜芦醇对CV026生长的影响。结果表明，白藜芦醇不影响CV026的生长。

图4 白藜芦醇对紫色杆菌素产量的抑制作用

2.5 白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌生物膜形成的抑制作用

如图5所示，蜂房哈夫尼菌在不同质量浓度白藜芦醇作用下能够显著抑制蜂房哈夫尼菌生物膜的形成(P<0.01)，最大抑制率达到79.1%，没有生物膜产生。图5还显示，浮游菌的OD不随白藜芦醇质量浓度的增加而改变，这证明白藜芦醇的生物膜抑制活性并不是由于其抗菌活性的作用。但是生物膜中细菌的OD会随白藜芦醇质量浓度的增大而减小。

图5 白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌生物膜形成的抑制作用

Fig.5 Inhibition of the biofilm formation ofH.alveiby resveratrol

2.6 白藜芦醇抑制蜂房哈夫尼菌游动能力

蜂房哈夫尼菌生物膜形成过程中，依赖于鞭毛运动的细菌运动能力和生物膜形成密切相关，并同时受到群体感应系统调控，干扰细菌鞭毛的合成过程能影响细菌的运动和定植能力，细胞的游动能力对其生物被膜的形成具有十分重要的作用[10]。如表1所示，在亚抑菌浓度下，白藜芦醇能显著抑制蜂房哈夫尼菌群体感应依赖的游动能力(P<0.01)。在质量浓度为16 μg/mL时，最大抑制率达到74.1%。如图6所示，随着白藜芦醇质量浓度逐渐增大，蜂房哈夫尼菌迁移距离缩短，游动能力逐渐降低。

表1 不同质量浓度白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌的作用

Tab.1 The effect of different concentrations of resveratrol onH.alvei

ρ/(μg·mL-1)d/mm抑制率/%OD600062.1±0.300.68±0.20243.3±0.530.20.69±0.10438.2±0.438.50.69±0.30830.4±0.651.00.69±0.101616.1±0.274.10.69±0.20

图6 白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌游动能力抑制作用

3 结 论

白藜芦醇在亚抑菌浓度下，能够抑制由群体感应系统调控的紫色杆菌CV026中紫色杆菌素的产量，并且具有浓度依赖性，当质量浓度为16 μg/mL 时紫色杆菌素产量最低，表明其具有群体感应抑制作用；白藜芦醇还能抑制蜂房哈夫尼菌生物膜形成及游动能力，质量浓度为16 μg/mL时抑制作用最大。研究结果为控制食品腐败、提高食品安全奠定研究基础。