西藏高原酸奶中乳酸菌产抑菌物质的抑菌活性及抑菌机制

杜 琨

(武警工程大学装备管理与保障学院，陕西西安 710086)

目前，影响人类公共健康和食品安全的最大食源性疾病是由细菌污染引起的，其中引起食源性疾病的主要病原菌有金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(Escherichiacoli)[1-2]。细菌污染食品后不但降低了食品的营养价值和品质，还会产生一些令人难以接受的感官性状和毒素。目前，我国常用的传统食品防腐剂分为有机防腐剂和无机防腐剂2种，有机防腐剂主要有山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基甲酸酯类等；无机防腐剂主要有亚硫酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐和二氧化硫等。传统防腐剂由于具有潜在的致癌性、致畸性、环保问题等，其安全性正越来越受到人们的关注。随着人们生活水平的不断提高和对健康的日益关注，人们对防腐剂类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求，所以，人们开始把目光投向天然防腐剂。天然防腐剂和化学合成防腐剂相比具有无毒、无副作用并有一定的保健作用等特性，己经成为国内外研究的重要课题。此外，天然防腐剂不仅为食品工业所需，医药、化妆品、饲料等行业均需要天然防腐剂，因此其市场前景非常好[3-4]。

高原产酸奶中含有多种天然抑菌物质，具有维持肠道菌群平衡、提高机体免疫力、促进营养物质的吸收等功能[5]。本试验拟从我国西藏地区高原自然发酵酸奶中定向筛选产抑菌物质的乳酸菌，通过优化发酵条件，生产抑菌物质，并进行纯化、鉴定[6-7]。目前，关于酸奶中获得的抑菌物质对微生物作用机制的报道很少。本研究选取金黄色葡萄球菌为试验对象，研究乳酸菌产抑菌物质抑制细菌生长的作用机制，旨在为乳酸菌产抑菌物质在饲料、食品、药品等领域的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌产抑菌物质：由笔者所在实验室从高原酸奶中分离得到乳酸菌，经添加营养物质、发酵优化、分离、纯化和冷冻干燥等制成乳酸菌产抑菌物质冻干粉[6-7]。将乳酸菌产抑菌物质冻干粉配制成浓度为3.13 mg/mL的水溶液，于4 ℃保藏备用。指示菌：金黄色葡萄球菌，由陕西师范大学食品工程与营养科学学院微生物发酵实验室提供；乳酸菌产抑菌活性物质的保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、溶血性链球菌(Streptococcus)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、乙醇酵母(alcoholyeast)、啤酒酵母(SaccharomycescerevisiaeHansen)等由西北农林科技大学提供；小肠结肠炎耶尔森氏菌、番茄灰霉病病菌、香蕉炭疽病病菌、水稻纹枯病病菌、油菜菌核病病菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、黑曲霉、黄曲霉等由陕西省微生物研究所提供。细菌培养采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，酵母菌培养采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(简称YPG培养基)，霉菌培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基)[8]。

TQHZ-2002A恒温振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；GHP-250恒温培养箱，扬州市三发电子有限公司；SB-3S-1 无菌操作台，上海博迅实业有限公司；CL-32L高压灭菌锅，上海医用核子仪器厂；CR21G冷冻离心机，日本日立；DELTA-320 pH计，Mettler-Tlelod公司；调温电热器，通州市申通电热器厂；PL-2002电子天平，Mettler-Tlelod公司；SPM-9500J3型原子力显微镜(atomic force microscope，简称AFM)，日本岛津公司。

本试验于2013年9月至2015年6月在陕西师范大学食品工程与营养科学学院微生物发酵实验室和畜产品实验室完成。

1.2 试验方法

1.2.1 原子力显微镜下观察乳酸菌产抑菌物质 原子力显微镜具有分辨率高、原位成像、不破坏样品、对材料的导电性无要求等特点，可以获得测量材料的微观形貌、表面粗糙度、表面电荷和微观力学性能等参数，是微观分析的常用工具之一。

(1)AFM制样。将乳酸菌产抑菌物质加入双蒸水中溶解，配成1 μg/mL溶液，取5 μL浓度为1 μg/mL的溶液，滴在新剥离的云母表面上，于室温、空气中干燥后，用原子力显微镜观测[9]。

(2)原子力显微镜观测。在室温大气环境中测量乳酸菌产抑菌物质的分子形态。采用轻敲模式，氧化硅探针材料为Si3N4(微悬臂长为200 μm，弹性系数为0.12 N/m)，所有力-距离曲线均采用同一探针在同一载荷速率下测量得到。

1.2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定[10]用二倍稀释法对100 mg/mL乳酸菌产抑菌物质溶液进行稀释，吸取2 mL乳酸菌产抑菌物质溶液和18 mL融化的培养基同时放入灭菌的培养皿中，调节pH值为2.5，充分混匀，使乳酸菌产抑菌物质的最终浓度为0.79、1.57、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mg/mL 8个梯度。待冷却后，用接种针划线在培养基上涂上浓度为106CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液，以无菌水作为空白对照组，每个浓度设3个重复。观察菌体的生长情况，培养皿中无菌生长的，此皿的乳酸菌产抑菌物质浓度即为其MIC值。

1.2.3 乳酸菌产抑菌物质抑菌谱测定[11]将供试菌种接种培养(细菌在37 ℃培养24 h，酵母菌和霉菌在28 ℃培养 48～72 h)后，用血细胞计数板对活化的菌液进行计数，用无菌水将菌液浓度调至106CFU/mL。

将配制好的培养基及培养皿、直径约为6 mm的滤纸片放入高压锅内进行灭菌(121 ℃，25 min)，灭菌后取出，放入无菌操作室内冷却至约50 ℃时，点燃乙醇灯，在乙醇灯周围进行操作。将培养基倒入已灭菌培养皿中，在无菌条件下用移液枪吸取适量菌悬液于培养皿中，用刮铲均匀涂布；用镊子夹取浸过乳酸菌产抑菌物质的滤纸贴于接种了菌种的培养皿中，设3次重复，以无菌水作为空白对照。细菌在恒温37 ℃条件下培养24 h，酵母菌和霉菌在恒温28 ℃条件下培养 48～72 h，采用十字交叉法测量抑菌圈的直径。

1.2.4 不同影响因素对乳酸菌产抑菌物质抑菌活性的影响

1.2.4.1 pH值对抑菌作用的影响 以金黄色葡萄球菌作为供试菌种，用酸碱溶液调节待测乳酸菌产抑菌物质溶液的pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。以未调pH值的乳酸菌产抑菌物质作为对照(pH值为3.65)，于37 ℃培养箱中培养金黄色葡萄球菌24h，测量抑菌圈直径。

1.2.4.2 温度对乳酸菌产抑菌物质抑菌作用的影响 将待测乳酸菌产抑菌物质分为2组，A组分别置于70、80、90、100 ℃ 水浴及121 ℃高压湿热条件下处理30 min后调节pH值为2.5，以金黄色葡萄球菌为供试菌种，测量抑菌圈直径；B组先调pH值为2.5，再分别置于70、80、90、100 ℃水浴及 121 ℃ 高压湿热条件下处理30 min，以室温下不经处理的乳酸菌产抑菌物质作为对照，于37 ℃培养箱中培养金黄色葡萄球菌24 h，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测量抑菌圈直径。

1.2.4.3 不同NaCl、蔗糖浓度对抑菌作用的影响 在乳酸菌产抑菌物质水溶液中加入NaCl并分别调节其浓度为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%；加入蔗糖并分别调节其浓度为0、1%、2%、3%、4%、5%，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，以无菌水作为空白对照，于37 ℃培养箱中培养金黄色葡萄球菌24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.4.4 紫外线照射对乳酸菌产抑菌物质抑菌作用的影响 将乳酸菌产抑菌物质水溶液分别在紫外线下照射5、10、15、20、25、30 min。以金黄色葡萄球菌作为指示菌，以无菌水作为空白对照，于37 ℃培养箱中培养金黄色葡萄球菌24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.5 乳酸菌产抑菌物质的抑菌机制

1.2.5.1 乳酸菌产抑菌物质对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响 将金黄色葡萄球菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养液中进行振荡培养，用血球计数板计数，取生长量为106CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液作为指示菌悬液，向其中加入浓度为MIC的乳酸菌产抑菌物质，每隔3 h取样，然后用紫外-可见分光光度计在650 nm下测定D650 nm，连续测定36 h。以时间为横坐标、以抑菌圈直径和D650 nm为纵坐标，分别绘制对照组和加药组的生长曲线。

1.2.5.2 乳酸菌产抑菌物质对金黄色葡萄球菌细胞形态的影响 用2.5%戊二醛固定细菌后，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)洗涤3次，每次10 min；然后依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脱水各1次，每次10 min；再用无水乙醇脱水2次，每次10 min；用包埋剂Epon 812定向包埋，用超薄切片机进行超薄切片，厚度为 50 nm 左右；用醋酸铀-柠檬酸铅双染色各30 min，再用蒸馏水冲洗，于37 ℃烘干，用H-600透射电子显微镜观察、拍照[12]。

2 结果与分析

2.1 原子力显微镜观察分析

由图1可以看出，在室温下观测乳酸菌产抑菌物质的分子图像清晰、稳定，分子形貌呈现出大小不一的树状结构，支链直径在6.01～21.46 nm之间，键高为65.19～77.35 nm。此外，从对乳酸菌产抑菌物质的AFM三维形貌观察可以看出，其树状结构上具有很多峰状突起，推测乳酸菌产抑菌物质分子链可能具有较多分支。经综合分析，推测乳酸菌产抑菌物质可能通过肽键先形成双螺旋，后缠绕形成较大的聚集体。

2.2 乳酸菌产抑菌物质最小抑菌浓度的测定结果

由表1可以看出，当乳酸菌产抑菌物质的浓度为 3.13 mg/mL时，金黄色葡萄球菌不能生长，而当乳酸菌产抑菌物质的浓度为1.57 mg/mL时，有金黄色葡萄球菌生长，因此可知，乳酸菌产抑菌物质对金黄色葡萄球菌的MIC为 3.13 mg/mL。

表1 乳酸菌产抑菌物质抑制金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)的测定结果

注：“-”“+”分别表示无、有金黄色葡萄球菌生长。

2.3 乳酸菌产抑菌物质的抑菌谱测定结果

本试验选择革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、链球菌、保加利亚乳杆菌、单增李斯特菌、藤黄微球菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌)、酵母菌和霉菌作为检测指示菌，测定乳酸菌产抑菌物质对各指示菌的抑菌活性。从表2可以看出，乳酸菌产抑菌物质具有较广的抑菌谱，对革兰氏阳性菌有很好的抑制作用，对部分革兰氏阴性菌有抑制作用，对酵母菌、霉菌没有抑制作用。从表2还可以看出，乳酸菌产抑菌物质对食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌等具有很好的抑制作用；对食品腐败菌，如藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌等的抑制作用较好，显示其在食品防腐作用中的应用潜力。但是乳酸菌产抑菌物质对霉菌和酵母菌没有作用。此外，乳酸菌产抑菌物质对很多植物的致病菌如香蕉炭疽病病菌、番茄灰霉病病菌、水稻纹枯病病菌、油菜菌核病病菌等有很好的抑制作用，说明它在植物疾病的防治方面也有很好的作用。

表2 乳酸菌产抑菌物质的抑菌谱

注：“-”表示抑菌圈直径<0.6 cm；“+”表示抑菌圈直径为 0.6～1.1 cm；“++”表示抑菌圈直径为1.1～1.4 cm；“+++”表示抑菌圈直径>1.4 cm。

据报道，乳酸乳球菌菌株产生的抗菌物质主要对革兰氏阳性菌起作用[13-14]。而本研究中的乳酸菌产抑菌物质不但对革兰氏阳性菌有效，而且对部分革兰氏阴性菌也有较强的抑制作用，显示其在食品保鲜防腐和植物疾病防治方面的应用潜力，也说明乳酸菌产抑菌物质具有较广谱的抗菌活性。

2.4 乳酸菌产抑菌物质抑菌活性影响因素研究

2.4.1 pH值对乳酸菌产抑菌物质活性的影响 由图2可以看出，在pH值为2～6的范围内，随着pH值的上升，乳酸菌的抑菌活性逐渐降低，当pH值为6.0～7.0时，乳酸菌产抑菌物质活性很低，这与Jiang等报道的结果[4，15]相似。因此可知，乳酸菌产抑菌物质适用于酸性食品或在酸性条件下食品的防腐保存。

2.4.2 不同温度处理对抑菌作用的影响 如图3所示，对于先经不同温度热处理，再将乳酸菌产抑菌物质溶液的pH值调回到2.5的试验组，随着温度升高，乳酸菌产抑菌物质的抑菌活性迅速下降，当温度达到100 ℃时基本失去活性。对于先调各组的pH值为2.5，再经不同温度热处理的试验组，随着处理温度的升高，抑菌活性逐渐降低，整个变化过程缓慢，当处理温度达到100 ℃时，其抑菌活性略有降低，这与许多关于乳酸菌产细菌素的理化特征的报道相符，细菌素是蛋白类物质，而一般高温会使蛋白质变性，使蛋白类细菌素失活，但是由于小分子肽类物质的分子量要比蛋白质小，结构相对简单，因此其稳定性和抗性比蛋白质强，由此推测乳酸菌产抑菌物质可能属于小分子肽类物质[16]。

2.4.3 不同NaCl、蔗糖浓度对抑菌作用的影响 从图4、图5可以看出，在乳酸菌产抑菌物质溶液中添加盐、糖后，能提高其抑菌活性，添加0.3%NaCl或2%蔗糖时，其抑菌活性最强，抑菌能力最强，表明0.3%NaCl或2%蔗糖对乳酸菌产抑菌物质的活性具有一定的增强作用，这可能是由于盐、糖能够影响微生物生长的渗透压，从而抑制微生物的生长。

2.4.4 紫外线照射对抑菌作用的影响 从图6可以看出，乳酸菌产抑菌物质水溶液在经过紫外线照射后，表现出较为稳定的抑菌活性，与未经紫外线照射的乳酸菌产抑菌物质抑菌活性相比，经过紫外线照射30 min的乳酸菌产抑菌物质的抑菌圈直径仅仅缩小了1.07 mm。说明紫外线照射对乳酸菌产抑菌物质的影响很小，乳酸菌产抑菌物质对紫外线的照射表现出较好的稳定性。可见在食品生产中，在使用乳酸菌产抑菌物质进行防腐的同时，可采用紫外线进行相应的杀菌处理。

2.5 乳酸菌产抑菌物质抑菌机制研究

2.5.1 乳酸菌产抑菌物质对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响 从图7可以看出，对照组从3 h开始进入对数生长期，18～24 h进入细菌稳定生长期，27 h进入衰亡期。而加入MIC浓度的乳酸菌产抑菌物质后，其生长曲线发生明显改变，金黄色葡萄球菌的生长受到抑制，菌体的生长一直处于较低水平，未出现菌体大量生长的对数期，说明乳酸菌产抑菌物质能够抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂。

2.5.2 乳酸菌产抑菌物质对金黄色葡萄球菌细胞形态的影响 由图8-A看出，在透射电镜下，正常的金黄色葡萄球菌细胞壁与细胞膜完整，结构紧密，细胞膜紧贴细胞壁，基本无空隙存在，胞质均匀，核区明显。由图8-B可以看出，经乳酸菌产抑菌物质作用3 h后，菌体有些变形、溶胀，位于细胞膜区出现一些小的空泡。由图8-C可以看出，经乳酸菌产抑菌物质作用9 h后，细胞质皱缩，导致细胞壁与细胞膜间空隙明显增宽，质壁分离，细胞壁疏松并出现皱褶，部分细胞壁与隔膜模糊不清，细胞质内出现许多空腔，这可能是由于乳酸菌产抑菌物质浸入细胞壁后使细胞膜蛋白遭到破坏，细胞膜收缩，从而导致细胞质固缩。可以看出，乳酸菌产抑菌物质能够导致金黄色葡萄球菌细胞质固缩，形成空洞，使细胞代谢无法正常进行，最终导致菌体死亡。

3 结论

乳酸菌产抑菌物质抑菌或杀菌活性高，抑菌谱宽，对食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌[17-18]、小肠结肠炎耶尔森氏菌和溶血链球菌等具有很好的抑制作用，对食品腐败菌，如藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌等的抑制作用较好，显示其在食品防腐作用中的应用潜力。此外，乳酸菌产抑菌物质对很多植物的致病菌如香蕉炭疽病病菌、番茄灰霉病病菌、水稻纹枯病病菌、油菜菌核病病菌等有很好的抑制作用，说明它在植物疾病的防治方面也有很好的作用。

乳酸菌产抑菌物质对紫外线和温度耐受力较强，表明乳酸菌产抑菌物质所含活性较为稳定；抑菌活性受pH值影响较大，在一定范围内，酸性越强，抑菌效果越好；NaCl和蔗糖对乳酸菌产抑菌物质的活性有一定的增强作用。出现以上结果，可能是由于盐、糖能够影响微生物生长的渗透压，从而抑制微生物的生长。

抑菌机制研究显示，经过乳酸菌产抑菌物质处理后的菌体细胞膜通透性、细胞壁及内容物均受到损害，导致细菌生长曲线发生变化。