岗梅种子生活力测定方法的优化

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(广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，岭南中药资源教育部重点实验室，国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室， 广东 广州 510006)

岗梅来源于冬青科植物梅叶冬青(Ilexasprella(Hook. et Arn.) Champ. ex Benth.)的干燥根及茎[1]，主产于广东、广西、湖南、江西等地，具有清热解毒、生津止渴、利咽消肿之功效，临床上用于治疗感冒发热、肺热咳嗽等疾病[2]。近些年来，市场上以岗梅为主要原料之一的三九感冒灵、外感风痧颗粒、广东凉茶等销售量大涨，对原药材的需求急剧上升，导致野生岗梅遭到大量采挖，造成其野生资源短缺，陷入中成药生产及临床应用供不应求的困境。因此，开展岗梅人工种植以保障市场供应已势在必行。

生产上岗梅主要以种子进行繁殖。中药材种子是中药材生产和质量控制的源头，种子质量的好坏决定了药材产量的多寡及质量的优劣。目前，我国种子质量检测的主要内容包括水分、净度、千粒重、发芽率、纯度和生活力，其中种子生活力水平的检测是种子质量检测体系中的一项重要内容，因为种子生活力水平的高低不仅关系到种子的质量，还影响到植物材料使用者的经济效益[3]。而种子生活力的检测却可以有效的避免这种情况的发生，因为种子生活力的变化先于种子发芽力的变化，种子生活力与种子的田间出苗率密切相关[4]。当前国内对岗梅的化学[5]和药理[6]有大量报道，但是对岗梅的种子及种苗仅有少量研究[7-8]，故有必要进一步探讨岗梅种子生活力测定的最佳方法及条件，以客观评价岗梅种子的质量。本试验以石正、仁居、仁居苗圃3个产地的岗梅种子为材料，分别用四氮唑染色法(TTC法)、溴麝香草酚蓝法(BTB法)和红墨水染色法测定岗梅种子的生活力，从而优化其生活力测定的方法及条件，并采用发芽率初步评价岗梅种子生活力测定方法的可靠性和准确性，为后续研究和生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 种子材料

岗梅种子于2016年6月采收自广东省平远县仁居镇、石正的岗梅种植基地和仁居苗圃，去除杂质后于4 ℃低温沙藏。经广州中医药大学詹若挺研究员鉴定为梅叶冬青(Ilexasprella(Hook. Et Arn.) Champ. ex Benth.)的种子。批号分别为仁居(GM 20160615-RJ)、仁居苗圃(GM 20160615-RJSY)和石正(GM 20160615-SZ)。

1.1.2 试 剂

十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、赤霉素(阿拉丁试剂有限公司)；红四氮唑、溴麝香草酚蓝(上海麦克林生化科技有限公司)；红色墨水(上海精细文化用品有限公司)。

TTC溶液的配制：称取1.819 3 g KH2PO4溶解于200 mL纯水中，标记为“溶液Ⅰ”，称取7.1704 g Na2HPO4·12 H2O溶解于300 mL纯水中，标记为“溶液Ⅱ”，将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合均匀即得磷酸缓冲液。再分别称取0.1、0.5、1.0 g的红四氮唑溶解于100 mL磷酸缓冲液中，即得到0.1%、0.5%和1.0%的TTC溶液。

0.1%BTB凝胶平板的制备：称取0.5 g溴麝香草酚蓝粉末和5 g琼脂粉溶解于煮沸过的500 mL纯水中，缓慢加热并不断搅拌，待琼脂完全溶解后停止加热，此时溶液显黄色，加入数滴氨水，使之呈蓝色为止，趁热倒入9 cm的培养皿中，冷却后用封口膜封口，4 ℃保存备用。

5%红墨水染色液的配制：取5 mL红墨水与95 mL纯水混合均匀后即可。

1.2 方 法

1.2.1 生活力的测定

取低温沙藏8个月的石正(GM 20160615-SZ)岗梅种子适量，洗去沙子、去除杂质后用吸水纸尽量把水吸干，用于TTC法、BTB法和红墨水染色法的生活力测定条件优化。获得3个测定方法的最适条件后，用于仁居(GM 20160615-RJ)和仁居苗圃(GM 20160615-RJSY)的岗梅种子的生活力测定。

1) TTC法。取GM 20160615-SZ岗梅种子随机分为2组，清水浸种4 h后，其中1组用手术刀沿种胚中心线纵切为两半，取带种胚较完好的一半放入装有四氮唑溶液的2 mL离心管中，采用L9(33)正交表对染色温度、染色时间及TTC浓度3个条件进行考察，见表1。染色结束后，倒去四氮唑溶液，纯水冲洗3次后观察。另1组岗梅种子沸水煮3 min后剖开， 于1%TTC中40 ℃避光染色9 h。观察岗梅种子的染色情况，记录有生活力种子的数量。每组含4个重复，每个重复50粒种子。判定标准：根据种子胚着色程度和对照组染色情况鉴定种子的生活力，种子的胚及胚乳染成红色为有生活力的种子，反之则为无生活力的种子[9]。

表1 TTC染色法正交试验因素与水平

水平染色温度(℃)TTC浓度(%)染色时间(h)1300.132350.563401.09

2) BTB法。取GM 20160615-SZ岗梅种子随机分为2组，浸种12 h后，其中1组岗梅种子分别整齐地埋于备好的0.1%BTB凝胶平板中，种子面与凝胶面平行。将平板分别置于25，30，35 ℃恒温箱中培养，于第18、20、22、24小时的时间点进行观察。另1组岗梅种子沸水煮3 min，按相同操作埋于0.1%BTB凝胶平板中，置35 ℃恒温箱培养。观察岗梅种子周围的黄色晕圈情况，记录有生活力种子的数量。每组4个重复，每个重复50粒种子。判定标准：种子周围出现黄色晕圈为有生活力的种子，反之则为无生活力的种子[10-11]。

3) 红墨水染色法。取GM 20160615-SZ岗梅种子随机分为2组，浸种4 h后，其中1组用手术刀沿种胚中心线纵切为两半，取带种胚完好的一半放入盛有5%红墨水溶液的2 mL离心管中，置于30 ℃恒温箱中染色10，15，20 min。染色完成后，倒去红墨水，纯水冲洗3次后观察。另1组岗梅种子沸水煮3 min，同样操作并在5%红墨水溶液中染色20 min。观察岗梅种子的染色情况，记录有生活力种子的数量。每组4个重复，每个重复30粒种子。判定标准：种子的胚及胚乳未染色者为有生活力的种子，反之则为无生活力的种子[10- 11]。

1.2.2 发芽试验

取去除沙子和杂质的3批岗梅种子各200粒用于发芽试验。每个批次的200粒种子随机分为4个重复，每个重复50粒种，参照李俊仁等[7]优化得到的最佳条件进行发芽试验。

1.2.3 数据处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。p<0.05为差异有统计学意义。

有生活力种子的比率(%)=(有生活力的种子数/测试种子总数)×100%；

发芽率(%)=(发芽种子数/50)×100%。

2 结果与分析

2.1 生活力的测定

2.1.1 TTC法

正交试验结果表明，以石正的岗梅种子为材料，生活力测定的最佳条件为1%TTC浓度于35 ℃染色9 h。各因素中只有染色时间对岗梅种子生活力测定具有显著影响(p<0.05)，而染色温度和TTC浓度对其生活力测定影响较小，3个因素对岗梅种子生活力测定效果的影响大小顺序为：染色时间>染色温度>TTC浓度(见表3)。用TTC法的最佳条件对石正、仁居和仁居苗圃的岗梅种子测定其生活力，分别为72.0%、69.2%、77.5%，单因素方差分析发现3个产地间的岗梅种子生活力没有显著性差异(p>0.05)。

2.1.2 BTB法

以石正的岗梅种子为材料，BTB法最佳的测定条件为35 ℃、培养22 h。其中，温度对BTB法测定岗梅种子生活力的结果具有显著影响(p<0.05)(见表5)。另外，当在同一个温度时，随着时间的延长，种子的生活力逐渐加强，其中25 ℃和30 ℃在第24小时表现出相同的生活力水平，而35 ℃在最开始的第18小时就表现为较高的生活力，在第22小时就达到100%，说明温度对BTB法测定岗梅种子生活力的结果影响较大(见表4)。再以BTB法的最佳条件对石正、仁居和仁居苗圃的3批岗梅种子进行生活力测定，测定结果分别为100%、49%、97%，说明在用BTB法于35 ℃、共培养22 h时，石正产地的岗梅种子生活力测定值最好。

表2 正交试验结果

因素染色温度(℃)TTC浓度(%)染色时间(h)有生活力种子的比率(%)实验1401.0348.5实验2300.5963.5 实验3400.1970.5 实验4301.0627.0实验5351.09 72.0实验6400.5658.5实验7350.534.0实验8350.169.5实验9300.130.0 均值130.226.717.5均值228.54232.7均值359.249.268.7极差2922.551.2

表3 单因素方差分析结果

源Ⅲ型平方和df均方FSig.校正模型6764.667a61127.44415.3510.062截距13884.694113884.694189.0500.005染色温度1784.2222892.11112.1470.076TTC浓度792.7222396.3615.3970.156染色时间4187.72222093.86128.5090.034误差146.889273.444总计20796.2509校正的总计6911.5568

表4 BTB法测定结果(阳性率/%)

培养温度(℃)培养时间(h)18202224 250.5±0.529.5±9.564.0±19.668.5±16.5300.0±0.02.5±2.533.0±7.567.0±5.43593.0±5.097.0±3.0100.0±0.0100.0±0.0

表5 单因素方差分析结果

源Ⅲ型平方和df均方FSig.校正模型15633.125a53126.6259.7920.008截距35752.083135752.083111.9710.000温度11501.04225750.52118.0100.003时间4132.08331377.3614.3140.061误差1915.7926319.299总计53301.00012校正的总计17548.91711

2.1.3 红墨水法

同样以石正的岗梅种子为试验材料，红墨水法的最佳测定条件为5%红墨水溶液于30 ℃染色20 min。红墨水法染色时间对岗梅种子的生活力测定没有显著差异(p>0.05)。再用红墨水法的最佳条件分别对石正、仁居和仁居苗圃的岗梅种子进行生活力测定，测定结果分别为98.3%、95%、94.2%，各产地间的生活力水平没有显著差异(p>0.05)。

表6 红墨水法测定结果

时间(min)有生活力种子的比率(%)1095.8±5.01597.5±5.02098.3±3.3

2.2 发芽试验

发芽试验结果表明，石正、仁居和仁居苗圃的发芽率分别为21%、13.5%、13%，各产地间的发芽率没有显著差异(p>0.05)。

表7 岗梅种子发芽结果

产地发芽率(%)石正21.0±3.8仁居13.5±4.4仁居苗圃13.0±3.5

3 讨 论

TTC法测定种子生活力水平的主要依据是有生活力种子的胚乳含有脱氢酶，具有脱氢还原作用，而无色的红四氮唑溶液能与活细胞内的三羧酸代谢途径中释放出来的氢离子结合，产生一种红色、稳定、不会扩散和不溶于水的三苯基甲替，能够有效地区分红色的有生活力部分和无色的死亡组织[12]。而BTB法测定生活力的原理是种子的活组织能进行呼吸作用释放出CO2，CO2溶于水中生成H2CO3，可释放出H+和HCO3-，使种子周围呈酸性，而本试验所配置的0.1%BTB溶液是经过加碱调整显蓝色，遇酸性溶液后会显示为黄色，从而可以直观地根据颜色的变化来区别有生活力的种子和死亡的种子[10-11]。另外，红墨水法测定岗梅种子生活力时，由于岗梅种子的种皮较硬，浸种4 h后，纵切时还是会对切口处的种子细胞造成损伤，容易被染成粉红色，造成误判，且其不能区分不同产地的岗梅种子生活力的情况，故红墨水染色法不适合用来测定岗梅种子的生活力。此外，将本试验优化得到的TTC法和BTB法测定的最佳条件相比，TTC法较BTB法的操作简便，缩短了浸种时间和染色时间，节省试剂用量，且比李俊仁等[7]的TTC法测定生活力的条件缩短了染色时间，降低了染色温度，故本研究优化的TTC法是岗梅种子生活力测定的更优方法。

本试验测定了石正、仁居和仁居苗圃3个来源的岗梅种子的生活力和发芽率，发现仁居苗圃产地的岗梅种子在3个测定方法中均表现出较高的生活力，但其发芽率只有13%；而石正产地的岗梅种子用TTC法测定其生活力为72%，其发芽率为21.0%，均表现出较高的测定结果，说明该产地的岗梅种子质量优于另外2个来源，可以用于生产岗梅种子苗。但是，3个产地的岗梅种子生活力的测定结果都远高于其发芽率测定结果，可能与其存在生理休眠有关，提高发芽率及田间出苗率的方法仍需进一步研究。