补中益气汤对III度脱垂性内痔组织中Fibulin-5表达影响的研究

孙锋，肖团有，陈辉，李玉英

1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405 2.珠海市中西医结合医院，广东 珠海 519000 3.广州市红十字会医院，广东 广州 510220

内痔为临床常见病，多发病。迄今为主，肛垫下移的机制尚未明确，引起内痔发生的机理亦尚未清楚。目前，利用分子生物学研究机理的方法已逐渐成为医学领域的主流，而运用中医中药治疗痔病更是经过了几千年的临床验证。因此，本研究在现代分子生物学层面，观察Ⅲ度脱垂性内痔患者服用补中益气汤及草木犀浸液片与单纯服用草木犀浸液片1周后，其内痔组织中Fibulin-5mRNA及蛋白表达的变化，以评估补中益气汤对Ⅲ度脱垂性内痔组织中Fibulin-5表达的影响，以期探究内痔的发生机理，为后续研究提供参考。

1 临床资料

1.1 一般资料 所有病例均为2014年9月—2016年3月广州中医药大学第一附属医院肛肠科门诊患者。均符合脾虚气陷型、Ⅲ度脱垂性内痔患者共59例，其中男44例，女15例；年龄30～61岁，平均(42.7±9.357)岁；病程6月～25年，平均(4.14±5.675)年。根据就诊顺序按照随机数字表法分为3组：治疗组(A组)20例、对照组(B组)20例、空白组(C组)19例。A组男16例，女4例；年龄(42.20±8.64)岁；病程(4.37±5.90)年。B组男15例，女5例；年龄(43.70±8.98)岁；病程(3.35±4.57)年。C组男14例，女5例；年龄(42.26±10.9)岁；病程(4.3±6.62)年。3组患者性别、年龄、病程等比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。疗程结束后，收取Ⅲ度脱垂性内痔治疗后的肛垫组织标本30例(均为自愿要求住院行手术治疗者，其余患者继续药物治疗或治愈而脱落)，分别来源于A、B、C组患者，再对应分组为A1、B1、C1组各10例。

1.2 诊断标准 参考《痔临床诊治指南(2006版)》[1]相关标准：Ⅲ度内痔可有便血，排便或久站及咳嗽、劳累、负重时有痔脱出，需用手还纳。脾虚气陷型：肿物脱出肛外，不易复位，肛门坠胀，排便乏力，便血色淡；面色少华，头晕神疲，食少乏力，少气懒言；舌淡胖，苔薄白，脉细弱。

1.3 纳入标准 符合上述诊断标准中Ⅲ度内痔且中医证型为脾虚气陷者；年龄大于16周岁，小于65周岁，且病程≥6月者；入组前1周均未服用任何药物者。

1.4 排除标准 不符合上述纳入标准者；妊娠期或哺乳期妇女；对服用本药过敏，或伴严重不良反应，不宜继续本研究治疗者；合并严重原发性慢性疾病、传染病患者；精神病患者、无自主能力、依从性差，无法配合治疗者；严重肾功能损害者；由于收集资料不全或无法判断疗效等影响实验结果者；治疗或观察期间自行退出、脱落及失访者。

2 治疗方法

2.1 A组 予草木犀流浸液片(日本·生晃荣养药品株式会社，注册证号H20160144)口服，每次1 600 mg，每天3次。联合补中益气汤治疗。处方：黄芪20 g，党参、陈皮各9 g，升麻15 g，当归、白术各12 g，柴胡、甘草各6 g。每天1剂，水煎，每次100 mL，每天3次，饭后温服。

2.2 B组 仅予草木犀流浸液片口服，每次1 600 mg，每天3次。

2.3 C组 仅作空白对照，不用药物治疗。

3组均以1周为1疗程，共治疗1疗程。疗程停止后第2天，根据患者意愿行手术治疗，收集肛垫组织标本再分组后进行免疫蛋白印迹法(Western blot)检测Fibulin-5蛋白，Real-time PCR检测Fibulin-5 mRNA表达。

3 观察项目与统计学方法

3.1 主要实验材料与主要设备 Western blot器；配胶试剂盒：P0012A；一抗稀释液：P0023A；一抗、二抗去除液：P0025A；Western转膜液：P0021A；RIPA裂解液：P0013A(以上试剂均购自碧云天生物技术研究所，江苏海门)。二抗：Anti-Rabbit IgG(H&L)HRP Conjugate，W4011；Anti-Mouse IgG HRP Conjugate，W4021(购自promega生物技术有限公司)。配胶、电泳、转膜相关器械均为Bio-Rad公司，移液枪(Eppendorf)，电泳仪(Tanon，EPS300)，紫外透射分析仪(Hema，UV-3A)，冷冻高速离心机(Hema，TGL-16R)，基因扩增仪(Hema，Hema9600)，数显恒温水浴锅(江苏环宇科学仪器，HH-4)，Real-time Quantitative PCR(applied biosystems，StepOnePlus)，化学发光成像分析仪，GE ImageQuant LAS 4000。PCR相关试剂耗材：PCR仪(Thermo Scientific公司，PikoReal 96 Real-Time PCR System)。Trizol(Invitrogen公司，#15596-026.RT试剂盒，Thermo Scientific公司，#K1622)；定量PCR试剂盒(Thermo Scientific 公司，#K0251)；Anti-Fibulin 5 antibody[1G6A4]。引物序列：β-Actin-R：CTCCTTAATGTCACGCACGAT，Fibulin-5-F： TCGCTATGGTTACTGCCAGC， Fibulin-5-R： AAGAGCC GTAGGTGTTGACG，GAPDH-H-R：GCCCAATACGACCAAATCC。

3.2 标本采集 在无菌条件下，取行直肠黏膜环切术后患者的肛垫组织标本，并将其放入预冷至4℃的医用生理盐水中进行快速清洗，切割出2份约0.5 cm长的标本，分别装入含RNAlater及含多聚甲醛的EP管中固定后，然后将固定在RNAlater中的标本及固定在多聚甲醛中的标本分别置于-80℃冰箱及4℃冰箱内低温保存。

3.3 检测指标 ①采用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测Fibulin-5蛋白；②Real-time PCR检测Fibulin-5 mRNA表达。

3.4 统计学方法 将所收集的数据建立原始数据库，采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。首先对数据进行正态性检验及方差齐性检验，对于符合正态性检验与方差齐性的计量资料采用单因素方差分析，配对t检验进行统计分析；对于不符合正态性检验，方差不齐或无法转换成方差齐性的计量资料则采用两相关样本非参数秩和检验、多独立样本非参数秩和检验进行统计分析。计数资料则运用χ2检验进行统计分析；等级资料运用多独立样本非参数K-W检验进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 qPCR相对定量结果 见图1、图2。从Fibulin-5溶解曲线、β-Actin溶解曲线显示出只有单峰且信号特异，说明引物是特异的，无杂带、无杂信号。

4.2 3组Fibulin-5 mRNA表达水平比较 见表1。3组间内痔组织标本中Fibulin-5 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。组间的两两比较：A1组Fibulin-5 mRNA表达水平高于B1组(P＜0.05)；A1组Fibulin-5 mRNA表达水平高于C1组(P＜0.05)；B1组Fibulin-5 mRNA表达水平高于C1组(P＜0.05)。提示3组中内痔组织标本中Fibulin-5 mRNA表达水平可能为A1＞B1＞C1。

4.3 3组Fibulin-5蛋白表达水平比较 见表2。3组间内痔组织标本中Fibulin-5蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(F=12.581，P=0.000＜0.05)。组间的两两比较：A1组Fibulin-5蛋白表达水平高于B1组(P＜0.05)；A1组Fibulin-5蛋白表达水平高于C1组(P＜0.05)；B1组与C1组Fibulin-5蛋白表达水平相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。提示3组中内痔组织标本中Fibulin-5蛋白表达水平可能为A1＞B1=C1。

4.4 3组Fibulin-5蛋白条带结果 见图3。从3组标本中Fibulin-5蛋白条带可以发现，A1组中Fibulin-5蛋白表达最强且集中。

图1 Fibulin-5溶解曲线

图2 β-Actin溶解曲线

表1 3组Fibulin-5 mRNA表达水平比较(±s)

表1 3组Fibulin-5 mRNA表达水平比较(±s)

分组A 1 B 1 C 1 n P值1 0 1 0 1 0 A 1 v s B 1 A 1 v s C 1 B 1 v s C 1 F i b u l i n-5 m R N A 0.7 6 0±0.1 2 6 0.6 2 0±0.0 7 9 0.4 3 0±0.1 1 6 0.0 0 8 0.0 0 0 0.0 0 1

表2 3组Fibulin-5蛋白表达水平比较(±s)

表2 3组Fibulin-5蛋白表达水平比较(±s)

分组A 1 B 1 C 1 n P值1 0 1 0 1 0 A 1 v s B 1 A 1 v s C 1 B 1 v s C 1 F i b u l i n-5蛋白2.1 9 0±0.1 6 6 1.9 6 0±0.1 5 8 1.8 2 0±0.1 7 5 0.0 0 5 0.0 0 0 0.0 7 1

5 讨论

Fibulin-5蛋白是细胞外基质成分，是弹性纤维的组成成分。它具有Fibulin家族的特有结构，也有自己特殊的结构，能与整合素结合的RGD模序(Arg-Gly-Asp，integrin-binding motif)，这个基序能介导内皮细胞黏附，与细胞表面的整合素α5β1，α4β1，αvβ3，αvβ5 和 α9β1 相结合，将弹性蛋白原锚定于细胞表面，这对形成弹性纤维十分关键。研究表明，Fibulin-5基因敲除的小鼠皮肤的成熟弹性纤维明显减少，并且介导Fibulin-5基因后发现弹性纤维数量增加，密度增高。表明Fibulin-5 mRNA与Fibulin-5具有正相关的用[2]。另有研究发现，Fibulin-5可上调TIMP-3和TIMP-1和下调MMPs系的表达[3]。说明Fibulin-5可通过调节这些基质金属蛋白酶及其抑制剂细胞外基质成分而影响弹性纤维的结构功能。Fibulin-5不仅具有指引弹性蛋白的功能，而且可以调节弹性蛋白与交联酶之间的相互作用，调节弹性纤维细胞之间的连接，具有调节细胞外基质弹性纤维成分合成成熟的弹性纤维功能。

图3 3组Fibulin-5蛋白条带

Fibulin-5不仅作用于弹性纤维的合成，还可以抑制新生血管的生成，降低微血管密度。研究发现，Fibulin-5可显著抑制小鼠体内的新生血管的生成，且可以减低肿瘤组织中的血管密度[4]。目前Fibulin-5是公认的内源性新生血管的抑制剂。它抑制新生血管的机制可能有以下两种：①血管内皮细胞中血小板反应素1(thrombospondin1，TSP-1)是抑制新生血管生成抑制因子之一，Fibulin-5可促进TSP-1的表达，从而起到抑制新生血管的生成；②Fibulin-5可抑制平滑肌细胞的增殖，迁移等功能而发挥其抑制血管生成的作用。

肛垫是人体的正常结构。肛垫上皮具有丰富的神经末梢，具有精确分辨大便性质的能力，因此它具有良好的控便作用。一般认为痔上黏膜环切术(PPH术)是悬吊肛垫，使下移的肛垫恢复到原来的位置，并没有切除内痔本身[5]。研究者通过对Ⅲ度脱垂性内痔患者行痔PPH手术，收取其标本进行病理学检查，发现其内含有肛垫的的特征性结构。韩炜等[6]对Ⅲ度脱垂性内痔患者行PPH术后，收取Ⅲ度脱垂性内痔组织进行研究发现，内痔组织弹性纤维结构发生改变，并且微血管密度计数明显增加，MMP9的表达也显著上调。随后，王振军等[7]进一步对Ⅲ度脱垂性内痔组织通过HE染色发现，与正常的肛垫组织比较，Ⅲ度脱垂性内痔组织中的弹性纤维数量减少，密度降低，并且窦状血管表现为管壁结构成分不足，弹性纤维不规则，血管内弹力板结构模糊不清，血管壁上可见大量的新生血管。

肛垫下移学说认为，脱垂性内痔是肛垫支持组织、黏膜下血管发生病理性改变导致肛垫移位的结果。主要临床症状表现为便血与痔核脱出。肛垫的支持组织是肌性结构，主要作用是固定肛垫，肛垫支持组织的松弛可导致肛垫下移。中医学认为，“脾主肌肉”，肌肉的丰满、营养的供给和功能的实现都需要脾胃功能的正常运作。脾胃虚弱，肌肉不充，功能弱化，在肛垫中可表现为肛垫支持组织的疏松；脾胃虚弱，气虚血液统摄无力，可表现为便血，日久导致气虚下陷，托举无力，可导致肛垫下移，表现为痔核脱出。

李东垣根据“补其中而升其阳”“下者举之”的原则，首创补中益气汤。补中益气汤中黄芪为君药。味甘入脾经，具有补中益气，升阳固表之功效，恢复中气功能，使脾阳得升。臣以人参，大补元气，元气可与中气互相转化，协调全身气机。白术、甘草补中健脾，恢复脾的运化，气血化生有源。气虚日久，血脉空虚，以当归养血和营。陈皮理气和胃，浊阴得将，脾胃升降相因。升阳风药升麻、柴胡升举阳气，使下陷的脏器恢复到原来的位置。

本研究在前辈“下者举之”的理论上，应用补中益气汤联合草木犀流浸液片治疗Ⅲ度脱垂性内痔患者，收集痔PPH术后收取Ⅲ度脱垂性内痔组织标本，运用Western blot法及qPCR检测检测其Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN是否表达。研究结果显示：在Ⅲ°脱垂性内痔组织标本中检测到了Fibulin-5蛋白及FiBulin-5mRNA的表达，并且FiBulin-5mRNA在3组中的表达水平表现为补中益气汤+草木犀浸液片组＞草木犀流浸液片组＞空白组，Fibulin-5蛋白在3组的表达情况为补中益气汤+草木犀浸液片组＞草木犀流浸液片组，补中益气汤+草木犀浸液片组＞空白组，草木犀流浸液片组与空白组中Fibulin-5蛋白表达无显著差异。表明补中益气汤可促进FiBulin-5 mRNA及Fibulin-5蛋白的表达。说明相对正常肛垫而言，内痔组织中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN的表达水平下调。

肛垫组织中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN的表达水平下调可能促进肛垫结缔组织中的弹性纤维结构发生改变，表现为排列不规则、断裂、弹性纤维含量减少、密度减低等现象，而减弱或失去弹性纤维的功能，促进肛垫结缔组织的老化；另一方面，肛垫组织中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN的表达水平下调可能使肛垫黏膜下窦状血管内的弹力板弹性纤维变性，表现为弹力板结构模糊；可能导致基质金属蛋白酶及其抑制剂的调节紊乱，窦状血管壁结构成分受到降解或合成不足，新生血管生成，最终促进肛垫下移。因此肛垫组织中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN的表达水平下调可能是脱垂性内痔形成的病理学机制。