炭疽芽孢苗诱导大鼠体液免疫的研究

任闪闪

（郑州工业应用技术学院，河南 郑州 451100）

炭疽杆菌（Bacillus anthraci）属于芽孢杆菌属，炭疽杆菌是人类历史上第一个被证实的病原细菌，该菌可以导致家畜、野生动物、人类的病原菌，其中人类的炭疽病是人畜共患.当前，通过对炭疽疫苗的免疫保护机制的研究，我们知道对于炭疽病的免疫主要体内通过体液免疫来完成，细胞免疫的作用主要是机体内起到辅助作用.我们知道机体内的体液免疫系统主要由参与体液免疫应答的器官、细胞和一些分子来构成.为了了解炭疽病疫苗在机体内体液免疫的应答机制问题，并且为后续疫苗的研究开发提供宝贵的经验，本文采用炭疽芽孢杆菌疫苗-A16R芽抱苗与分别从三个角度研究大鼠的脾脏、骨髓和外周血，研究感染炭疽病小鼠体液免疫应答机制.

1 实验材料及方法

1.1 主要材料

SD大鼠（许可证SCXK(湘)2014-0010），长沙天勤生物科技有限公司；酸水解酪蛋白，西安浩天生物工程有限公司；酵母提取物，青岛藻蓝生物科技有限公司；胰蛋白胨，山东玉宝生物科技有限公司；实验用PA血清，实验室自备；BCA蛋白测定试剂，上海欧金实业有限公司.

1.2 主要仪器

RP-1500型pH计，上海阔思电子有限公司；YM-COS-100C型恒温摇床，上海豫明仪器有限公司；TD-5A型低温高速离心机，常州市万丰仪器制造有限公司；LAB-F6型蠕动泵，保定申辰泵业有限公司；微量加样器10-1000μL，上海启闵生物科技有限公司；Hz-0008型电子天平，上海诺萱科学仪器有限公司；LRH-150BOD型恒温培养箱，上海印溪仪器仪表有限公司.

2 炭疽A16R芽孢苗的制备

炭疽芽孢杆菌毒株A16R为本实验室保存备用.检查合格后，按照要求制备接种一批种子管，在4℃留存以备使用.

将种子管中移种到LB琼脂平板中，在管中挑选合适的菌落接种到LB琼脂斜面培养基内，在37℃培养18个小时，然后用无菌的生理盐水润洗，制备菌液，接种LB琼脂培养基罗氏瓶，保证菌液可以平铺在LB培养基的表面，保持该状态在37℃恒温培养箱中培养24个小时，然后在该状态下温度调整到28℃继续培育8天，每天定期检查涂片观察芽孢生长情况，并且检查培养基是否有杂菌生长以及观察期变化.当芽孢生成率＞90%以上时，这是停止培养.通过生理盐水润洗菌苔，转移灭菌.在50℃16h断链，在75℃30min杀死繁殖体，然后加入与润洗体积相同的灭菌甘油盐水，最后取菌液接种平板、肉汤各一支，放置在37℃恒温培养箱中继续培育24h，便为炭疽芽孢苗制剂，将其分装到等量小瓶中，保存在4℃恒温冰柜内[2].

3 炭疽A16R芽孢苗诱导SD大鼠ASCs的动态观察

3.1 炭疽A16R芽孢苗对免疫SD大鼠血清生成动态变化

表1 炭疽A16R芽孢苗SD大鼠血清生成动态变化

SD大鼠通过30天的诱导免疫之后，观察了炭疽A16R芽孢苗一针免疫和二针免疫的动态变化，炭疽A16R芽孢苗免疫之后的SD大鼠血清IgG在免疫7天之后就被检测出，随着天数的增加抗体呈现上升状态，可能与芽孢在大鼠体内不断增值有关，二针免疫之后3天和7天抗体效价缓慢上升，在14和30天之后上升明显（P＜0.05）.

3.2 炭疽A16R芽孢苗对免疫SD大鼠脾脏ASCs生成动态变化

炭疽A16R芽孢苗免疫之后的SD大鼠脾脏的分泌细胞ASCs在一针免疫之后7天时可以检测到，在14天时SD大鼠脾脏的分泌细胞ASCs明显升高，30天时SD大鼠脾脏的分泌细胞ASCs上升变缓（P＜0.05）；SD大鼠通过二针免疫之后脾脏的分泌细胞ASCs在3天时明显上升，在14天时显著上升（P＜0.01），通过二针免疫后30天时脾脏的分泌细胞ASCs下降到与对照组水平相近情况并且无显著性差异（P＞0.05）.

表2 炭疽A16R芽孢苗对免疫SD大鼠脾脏ASCs生成动态变化

3.3 炭疽A16R芽孢苗对免疫SD大鼠骨髓ASCs生成动态变化

表3 炭疽A16R芽孢苗对免疫SD大鼠骨髓ASCs生成动态变化

炭疽A16R芽孢苗免疫之后的SD大鼠骨髓的分泌细胞ASCs在一针免疫之后7天与14天时骨髓中ASC没有检测到，一针免疫之后在30天时可以检测到少量SD大鼠骨髓的分泌细胞ASCs；通过二针免疫SD大鼠骨髓的分泌细胞ASCs在7天时明显升高（P＜0.05），并在二针免疫SD大鼠骨髓的分泌细胞ASCs14天时显著增加（P＜0.01），14天至30天缓慢降低达到与一针免疫30天时的免疫水平.

3.4 炭疽A16R芽孢苗对免疫SD大鼠外周血ASCs生成动态变化

炭疽A16R芽孢苗免疫之后的SD大鼠外周血的分泌细胞ASCs在一针免疫之后在14天时被检测出，30天时缓慢增加；在二针免疫之后SD大鼠外周血的分泌细胞ASCs3天时明显上升（P＜0.05），但是在7天时外周血的分泌细胞ASCs3缓慢上升数目与3天时相差不大，14天时外周血的分泌细胞ASCs3明显上升（P＜0.05）.

表4 炭疽A16R芽孢苗对免疫SD大鼠外周血ASCs生成动态变化

4 实验结论

对炭疽A16R芽孢苗诱导SD大鼠ASCs的动态观察，进行了30天的免疫得出，炭疽A16R芽孢苗诱导SD大鼠ASCs的动态观察中得出，每次二针免疫之后ASCs数量就会明显上升，但是周期较短，大约经过10天之后，ASCs数量就会下降.同时在SD大鼠的骨髓中的ASCs检出的时间较晚，免疫一般是14天时才能在二针免疫时检出.在二针免疫之后SD大鼠免疫效果都会有激发状态，根据细胞的增殖数量进行排序为外周血＞骨髓＞脾脏.以上从实验中得出的结果还存在一些不足，但是通过以后得研究以期可以作为人用疫苗的一种评价方法.