肺腺瘤小鼠模型的建立及其血生化、血常规、尿常规、病理检测

张修彦，高亚奇，陈伟盛，梁 宁，詹纯列

(广州军区广州总医院动物实验中心，广州 510010)

肺癌是世界各国常见的恶性肿瘤之一，它严重威胁人类健康，近20年发病率逐年上升。估计到2030年，全球将有830万人死于吸烟有关的疾病，其中肺癌占3.1%[1]。非小细胞肺癌占肺癌的80%以上。在非小细胞肺癌中，RAS是最常突变的基因，约25%的肿瘤可检测到[2]。B6.129S4-Krastm4Tyj/J携带KRASG12D点突变和Loxp-Stop-Loxp序列，KRASG12D不表达，从鼻腔滴入Cre腺病毒，可以启动KRASG12D的表达，从而诱导肺癌且肺癌发生率很高[3,4]。本研究利用此方法诱发肺腺瘤，对其进行血生化、血常规、尿液、病理检测，得到一些基础数据，供有需要的人员参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级B6.129S4-Krastm4Tyj/J小鼠及SPF级野生型小鼠从南京模式动物中心冷冻复苏获得。体重18～22 g，1.5月龄，B6.129S4-Krastm4Tyj/J小鼠7只(雌3只，雄4只)，野生型3只(雌1只，雄2只)。实验分组为B6.129S4-Krastm4Tyj/JCre处理组4只(2只雌，2只雄)，B6.129S4-Krastm4Tyj/J对照组3只(1只雌，2只雄)，野生型对照组3只(1雌，2只雄)。实验动物生产许可证号：SCXK (苏) 2015-0001。实验动物饲养于广州军区广州总医院动物实验中心屏障环境中，使用许可证号：SYXK (粤) 2014-0100，饲喂购自广东省医学实验动物中心的无菌鼠料。饮用水为经消毒过滤的自来水，饲料和水自由摄取。每周更换两次垫料和笼具，进出屏障环境的物品进行严格消毒，严格遵守屏障系统SOP。小鼠取材、建模在超净工作台中进行。实验过程中，根据实验动物3R原则，给予实验动物关怀。实验设计符合福利伦理要求，实验动物福利伦理批准号：201801203。

1.2 主要试剂与仪器

Cre腺病毒(5 × 1010，100 μL购自百恩维生物技术有限公司)。One Step Mouse Genotyping Kit(厂商Vazyme)、URIT尿试纸条(桂林优利特医疗电子有限公司生产)、ALT、AST、ALP、TP、ALB、GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C、BUN、CRE、T-BIL、D-BIL、CK、UA试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)、Trizol(TAKARA公司)，Bestar qPCR RT kit(DBI公司)、Bestar qPCR MasterMix(DBI公司)、DEPC(MACKLIN公司)、异氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)MEM培养基(广州威佳科技有限公司)、石蜡(广东大川特种蜡有限公司)、环保透明剂(武汉宏兹生物技术有限公司)、曙红(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、苏木素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、环保封片胶(武汉宏兹生物技术有限公司)。

超净工作台(苏州净化设备公司)、紫外分光光度计UV-1206(日本Shimadzu公司产品)、冷冻离心机SCR20B(日本Hitachi公司产品)、台式低温高速离心机Z323K(德国Hermle公司产品台式)、高速离心机TGL-16G(上海安亭科学仪器厂产品)、水平式电泳仪(北京东方仪器厂产品GDS7600)、空气恒温振荡器(江苏大仓医疗仪器厂产品)、ABI Real time PCR仪(ABI公司)、Stratagene Real time PCR仪(Agilent公司)、PCR扩增仪(杭州晶格科学仪器有限公司)、电子天平BS210S(日本Satorius公司产品)、尿液分析仪URIT-330(桂林优利特医疗电子有限公司)、全自动血液细胞分析仪BC-5000(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)、全自动生化分析仪日立7020(日本柱式会社日立高新技术)、RWD510小动物麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、全自动脱水机ASP300S型(Leica®)、生物组织包埋机EG1150型(Leica®)、轮转切片机RM2235型(Leica®)、摊片机HI1210型(Leica®)、烘片机HI1220型(Leica®)、自动染色机AutoStainer-XL型(Leica®)、Olympus®生物显微镜BX43型、Olympus®显微图像软件CellSens Dimension。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠基因型鉴定

取3～5 mm小鼠尾尖，根据需要裂解样品数量配制适量1×裂解液(4 μL Proteinase K + 200 μL 1× mouse tissue lysis buffer),在灭菌1.5 mL EP管中，添加200 μL 1×裂解液至所需裂解组织中(确保组织全部浸末至裂解液中)，涡旋震荡后在55℃水浴中孵育30 min，孵育完成后，将样品置于沸水浴中加热5 min灭活Proteinase K,将裂解产物涡旋震荡充分混匀后，12 000 r/min离心5 min，将上清转移至另一灭菌EP管中，取适量做PCR扩增，剩余上清保存于-20℃。引物信息见表1，PCR反应体系见表2，反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。

1.3.2 小鼠肺腺瘤动物模型的建立

用小动物气体麻醉机对小鼠进行麻醉，再以AdCre 100 μL(1 × 109)分别滴入B6.129S4-Krastm4Tyj/JCre组及野生型对照组两边鼻孔。AdCre滴液构成为2×109AdCre 50 μL加45 μL MEM培养基和6 μL 2.5 mol/L的氯化钙[4]。每7 d重复一次，共四次。在第30天处死小鼠取肺组织进行石蜡包埋、切片、HE染色。

1.3.3 尿常规、血常规、血生化检测

利用小鼠代谢笼采集12 h尿液用于尿常规检测。EDTA采血管眼眶采血用于血常规检测。干燥管眼眶采血用于血生化检测。

1.3.4 肺腺瘤荧光定量PCR检测Cre表达

以Cre序列为模版设计引物Cre F：5’-TTAA TCCATATTGGCAGAACG-3’,Cre R：5’-AGACGGAA ATCCATCGCTC-3’,内参β-actin F：5’-CATTGCT GACAGGATGCAGA-3’，β-actin R：5’-CTGCTGGA AGGTGGACAGTGA-3’。提取B6.129S4-Krastm4Tyj/JCre处理组、野生型对照组肺组织RNA，拟转录cDNA，荧光定量PCR检测Cre表达情况。

1.3.5 肺腺瘤病理学检查

肺组织标本经取材、固定、修块、流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后，石蜡切片、HE染色、封片。显微镜观察组织结构及细胞形态。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 基因鉴定结果

基因鉴定结果表明2、13、14、16、18、19、20基因型为Kras+/-，为实验所需阳性鼠。21、22、23为野生型对照。见图1。

2.2 肺腺瘤小鼠血生化、血常规、尿常规指标

测定结果表明：肺腺瘤小鼠与对照组相比低密度脂蛋白胆固醇、平均血小板体积升高，且差异有显著性(P<0.01)；直接胆红素与对照组相比升高、高密度脂蛋白胆固醇与对照组相比降低，且差异有显著性(P<0.05)。见表3～5。

表1 引物信息

表2 PCR反应体系

2.3 荧光定量PCR结果

荧光定量PCR结果显示，B6.129S4-Krastm4Tyj/JCre组及野生型对照组鼻腔滴入Cre腺病毒的小鼠，肺组织能够表达Cre。见图2。

肺部腺瘤：肺部见多处肿瘤、膨胀性生长、边界清晰，瘤细胞呈立方上皮样、排列呈不规则腺管状，未见核分裂像。见图3。

2.4 肺腺瘤造模结果

解剖取材发现4只阳性鼠均发现肿瘤,对照组未发现肿瘤，肿瘤数量见表6。

图1 Kras基因鉴定Figure 1 Identification of the Kras gene

测定项目Item肺腺瘤Pulmonary adenoma对照组ControlP值P-value谷丙转氨酶Alanine aminotransferase (ALT)26.75±2.5075.00±32.790.13谷草转氨酶Aspartae aminotransferase (AST)147.25±32.90232.00±65.780.07碱性磷酸酶Alkaline phosphatase (ALP)24.25±16.8424.67±2.520.26总蛋白Total protein (TP)64.50±2.5562.05±1.570.29白蛋白Albumin (ALB)33.33±1.6233.87±0.550.57球蛋白Globulin (GLOB)31.18±1.5628.63±1.050.06白蛋白/球蛋白Albumin/Globulin (A/G)1.07±0.061.18±0.030.04葡萄糖Glucose (GLU)4.93±1.905.27±2.760.85总胆固醇Total cholesterol (TC)1.95±0.272.29±0.180.10甘油三酯Triglycerides (TG)1.00±0.220.95±0.110.76高密度脂蛋白胆固醇High density lipoprotein cholesterol (HDL-C)0.97±0.111.34±0.1880.02低密度脂蛋白胆固醇Low density lipoprotein cholesterol (LDL-C)0.11±0.010.05±0.010.00尿素氮Urea nitrogen (BUN)8.62±0.959.10±3.130.82肌酐Creatinine (CRE)11.70±2.6210.70±0.400.28总胆红素Total bilirubin (T-BIL)1.38±0.400.73±0.100.05直接胆红素Direct bilirubin (D-BIL)0.68±0.150.37±0.070.02直接胆红素/总胆红素Direct bilirubin/Total bilirubin (D/T)0.50±0.040.51±0.060.81间接胆红素Indirect bilirubin (I-BIL)0.70±0.250.51±0.060.07肌酸激酶Creatine kinase (CK)1363.25±711.441610.67±499.420.62尿酸Uric acid (UA)31.25±1.2639.00±4.360.08

表4 肺腺瘤血常规指标±s)

表5 肺腺癌小鼠尿常规指标±s)

注：A：扩增曲线；B：溶解曲线。图2 Cre mRNA的荧光定量PCR鉴定Note. A: Amplification curve. B: Dissolution curve.Figure 2 Quantitative PCR analysis of Cre mRNA

小鼠序号Serial number of mice肿瘤数量(个)Number of tumors肿瘤体积(mm3)Tumor volume137.40±2.52259.92±8.273515.07±6.124413.61±5.99平均值Average value4.2510.81±6.38

图3 肺肿瘤(HE染色，× 100、× 400)Figure 3 Histology of the mouse lungs. HE staining (× 100, × 400)

3 讨论

利用B6.129S4-Krastm4Tyj/J小鼠鼻腔滴注Cre腺病毒诱导产生肺肿瘤的方式非常方便也很高效，4只阳性鼠均产生多处肺腺瘤,平均个数4.25个，体积(10.81±6.38) mm3，B6.129S4-Krastm4Tyj/J对照组及野生型对照组均未发现肿瘤。如果延长实验周期,预计可获得肺腺癌模型。低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇负责胆固醇运输，低密度脂蛋白胆固醇负责将胆固醇转运到肝外组织细胞，高密度脂蛋白胆固醇则相反[5]。已经有研究报道在多个部位HDL-C与癌的反比例关系，其中包括肺部[6-8]。本研究中肺腺瘤小鼠的高密度脂蛋白胆固醇比对照组低，与之前研究结果一致。Catarina Rodrigues dos Santos等[9]统计了244个乳腺癌患者，发现低密度脂蛋白胆固醇含量高的病人肿瘤更大、有更高的分化等级、更高的增生比率。本研究发现肺腺瘤小鼠低密度脂蛋白胆固醇比对照组高。胆红素主要在肝脏代谢，包括肝细胞对血液内胆红素的摄取、运载、未结合胆红素转化为结合胆红素、结合胆红素胆汁排泄等一系列相互影响的生理过程。有研究表明胆红素在肺癌中表现出抗氧化和抗肿瘤的作用[10 - 11]。Song等[12]的研究表明低水平直接胆红素与晚期非小细胞肺癌和预后差相关,血清胆红素是非小细胞肺癌的独立预后指标。而我们的实验结果显示肺腺瘤小鼠的直接胆红素指标高于对照组，这可能是由于肺腺瘤小鼠肝脏疾病引起，具体原因有待进一步验证。