58份桃种质资源抗寒性评价

王小丽，方伟超，刘云鹤，赵 佩，毛冬敏，王新卫

(中国农业科学院 郑州果树研究所，河南 郑州 450009)

桃(Prunuspersica)原产我国，属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)桃亚属(Amygdalus)，是我国第3大落叶果树[1]，其面积和产量均居世界首位[2]。在较冷的北方地区，低温成为制约桃树安全越冬、丰产、稳产的关键因子，所以，研究桃品种抗寒性对于栽培地选择、引种具有一定指导意义。有关桃抗寒性方面的研究，大多是在田间自然条件下展开。作者通常对冬季极端低温下受冻害桃树的不同器官展开分析，如花芽、叶芽、枝条、树干等，同时有针对性的提出一些防冻及补救措施[3-6,19-21]。因极端低温发生具有局域性以及某一区域栽培品种种类通常有限，造成大多数桃品种抗寒性无法评估，直接导致引种不当而引发的冻害问题，进而引发严重的经济损失。所以，模拟人工低温条件研究桃抗寒性显得很有必要。目前，一些研究人员在人工模拟低温条件下，对一些桃品种抗寒性做了相关评价，如王召元[9]等在0～-40℃人工模拟低温梯度下，对9份桃品种的抗寒性做了评价，表明LT50分布在-20～-25℃之间，与枝条木质部比率及木质部厚度/皮层厚度呈极显著负相关，与皮层比率呈正相关，试验最终得出‘木质部比率和皮层比率’可作为鉴定桃抗寒性的有效指标。张海旺[8]等在4～-70℃低温梯度下，以2份桃品种为材料，研究电阻抗与抗寒性之间的关系，表明胞外电阻率可作为枝条抗寒性的最佳指标。杨春祥[10]等在0～-9℃低温梯度下对4份油桃桃抗寒性展开研究，表明蕾期抗寒性大于盛花期，盛花期大于幼果期。刘天明[7]等在-16～-30℃低温梯度下，对82份桃品种抗寒性展开研究，表明桃一年生枝条抗寒性最高(-19～-27℃)，叶芽次之(-18.5～-26.1℃)，花芽最小(-17～-24℃)；枝条不同结构的抗寒顺序依次为韧皮部>木质部>形成层>髓；作者认为-23℃可作为桃能否安全越冬的临界温度。这些研究均在人工模拟低温梯度下研究了桃树的抗寒特性，并明确了不同组织器官的抗寒差异性，但因受资源种类限制，研究结果缺乏系统性。本文以来源于我国58份桃种质为试验材料，测定不同低温处理下细胞电解质外渗率，同时结合Logistic方程，求得半致死温度(LT50)，确定各种质的抗寒水平，以期发掘优异抗寒种质，为抗寒性品种选育及引种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用58份材料均来自于中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质郑州桃圃(表1)。采样树体均为多年生植株，露地栽培，管理水平一致，生长势良好。每份种质选取生长势相近的1年生长度、粗细一致的36根休眠枝条。

1.2 处理

将休眠枝条剪去两端，留约30 cm，两端封蜡，先后用自来水、蒸馏水冲洗干净。每份种质取枝条约36根，分成12组(对应12个温度梯度)，置于超低温冰箱的4℃处理温度中，12 h之后，取出第1批枝条，以5℃/h的速率降温，到达设定温度后，在此温度中放置12 h。同样的方法处理第2批枝条、第3批枝条，直至最后一批枝条。每一批处理过的枝条在0℃放置8 h后可用于测定电解质外渗率。12个温度梯度依次为4℃、-3℃、-6℃、-9℃、-12℃、-15℃、-18℃、-21℃、-24℃、-27℃、-30℃、-33℃。

1.3 指标测定

将处理后的枝条剪成2 cm长的小段(避开芽眼)，混合均匀，用无离子水冲洗3遍，用电子天平称1 g枝条放入75 mL试管中，加入40 mL无离子水，每份种质重复3次。真空渗入30 min后，室温下静置12 h，用电导仪测定煮前浸提液的电导值，然后再将试管置于沸水中，封口，煮沸20 min后开封，在室温下放置4 h，再次测定电导值，同时测无离子水的电导率，计算相对电导率，之后利用以下公式测定细胞伤害率(即电解质外渗率)[11]。

细胞伤害率=(样品低温处理后电导率-蒸馏水的电导率)/(样品煮后电导率-蒸馏水的电导率)×100%

转化细胞伤害率y′=ln[(k-y)/y]

将Logistic方程y=k/(1+ae-bt)转化为ln[(k-y)/y]=lna-bt，变成转化细胞伤害率y′与处理温度t的直线方程，通过直线相关求出系数a、b值，再由t=lna/b求出拐点温度，即半致死温度LT50。y为细胞伤害率，t代表冷冻温度，k为细胞伤害率的饱和容量为100[12]。

数据处理使用Excel2013、Spss19.0软件。

2 结果与分析

2.1 桃种质不同低温的电解质外渗率变化

图1表明，处理温度从4℃降至-3℃，大多数种质的电解质外渗率呈下降趋势，可能是低温初期的自我保护机制发挥作用。这时细胞刚受到低温胁迫，质膜功能正常，通过减少物质外运率，以降低胞质溶液的结冰温度，进而适应低温胁迫。处理温度从-3℃降至-21℃，大多数种质电解质外渗率变化较平稳，仅有6.11%的上升幅度，可能是这个温度段内，质膜虽受到不同程度的损伤，但损伤能被及时修复，即低温损伤与修复处于平衡状态。处理温度从-21℃降至-33℃，所有测试种质外渗率呈上升趋势，且上升幅度较大，达39.22%，可能是这个时间段内，质膜受到严重损伤，无法及时修复，导致电解质外渗率大增，从而出现上升态势。

表1 试验种质材料

2.2 桃种质半致死温度比较

应用Logistic拟合方程对处理温度下的细胞伤害率进行回归分析，计算供试种质半致死温度。结果表明，处理温度与电解质渗出率之间呈极显著负相关的种质有46个，相关系数在0.710～0.924，呈显著负相关的有12个，相关系数在0.615～0.708，说明半致死温度与Logistic方程相关性高，数据可靠。58份种质半致死温度变化范围在-17.31～-44.13℃，其中-17～-25℃的占6.9%，-25～-30℃的占22.4%，-30℃至-35℃的占60.3%，-35～-45℃的占10.3%，说明大多数桃种质半致死温度集中在-25～-35℃，该温度范围内，大多数桃种质质膜开始受到严重损伤，并开始进入半致死状态，如果温度继续下降，质膜所受损伤将不可恢复，具体数值见表2。

2.3 桃种质抗寒性聚类分析

采用欧氏距离及半致死温度对生育地分布在全国各地的桃种质进行类平均法(UPGMA)聚类分析(图2)。结果表明，在欧式距离为6.87的情况下，58份桃种质被聚为3类：2010西藏17、2010西藏28、2010西藏32、2010西藏54聚为一类，均为来源于青藏高原的地方品种，抗寒性最弱。夏至早红、江村4号、丁家坝青皮桃聚为一类，其中前者为育成品种，后两者均为来源于西北高旱地区的地方品种，三者抗寒性最强；其余51份被聚为一类，半致死温度在-27.61～-35.74℃，这些种质在4.58的欧式距离下，又被分为2类。其中一类半致死温度在-27.61～-30.91℃，地方品种10个，占所有测试地方品种的35.7%，选育品种及品系9个，占所有测试选育品种的30%。另一类半致死温度在-31.34～-35.74℃，地方品种12个，占所有测试地方品种的42.8%，选育品种20个，占所有测试选育品种的66.7%。以上表明，所有测试的地方品种，抗寒性强弱分布较均匀，可能和青藏高原东南部、西北地区的复杂地理特征、气候特征有关。所有测试的选育品种及品系，抗寒性强的所占比例居多，可能和育种工作者对抗寒性状的重视程度有关。

图1 处理温度与细胞伤害率的关系

3 结论与讨论

果树受到低温胁迫时，质膜透性会增加，电解质会出现不同程度的外渗[12]。电解质常以电解质外渗率的方式测定，通常电解质外渗率越高，质膜受损伤程度越严重，反之亦然[13,26]。电解质外渗率变化常出现在枝条形态变化之前，因此可作为果树受冻害的生理指标。多数研究表明，在一定的低温范围内，电解质外渗率变化呈‘S’型曲线，即先缓慢增加，然后激增，最后又缓慢增加。开始激增的温度因果树类型不同而存在差异，如梨树开始激增温度为-25℃[17]，苹果为-30℃[11]，野生柑橘为-10℃左右[22]，葡萄为-20℃[25]，火龙果为4℃[15]。本试验中，处理温度从4℃降至-21℃时，大多数种质电解质外渗率变化趋势平缓，-21℃降至-33℃时，电解质外渗率变化趋势上升，且上升幅度较大(39.22%)，表明开始激增的温度为-21℃，该温度之前的一段低温范围内，细胞质膜的低温损伤与修复处于动态平衡之中，而该温度之后的一段低温范围内，低温损伤大于修复，质膜损伤程度逐渐加重，所以，该温度可作为桃抗寒性评价的临界温度，可用于桃树引种及冬季管理等方面。

已有研究表明，桃树[7]、梨树[16-17]、苹果树[18]、柑橘[14]、火龙果[15]枝条半致死温度均能准确的反映其抗寒性，表现为半致死温度越低，抗寒性越强。本研究表明，82.7%的参试桃种质，其枝条半致死温度集中在-25～-35℃，该温度已经超出自然栽培的最低气温，说明大多数桃种质具有较强的抗寒潜力；10.3%的种质，其枝条半致死温度集中在-35～-45℃，说明这些种质抗寒性强，可作为引种对象，同时也可作为育种亲本，培育抗寒品种。

果树抗寒性是其长期适应低温环境而形成的一种特性，具有遗传潜质，同时受生长环境影响。抗寒相关基因的表达通常具有低温诱导特性，即在适温生长时，这些基因不表达，只有在受到低温胁迫时，才能转录合成相关抗冻蛋白[23-24]。抗寒相关基因的传播除了环境因素外，还受到人为因素影响，尤其是远距离传播时，人为因素更发挥着重要作用。这主要是因为果树具有商品价值，可以用作商品进行交换，其种子通过这种途径便可分布在不同地方。我国幅员辽阔，几千年前东西之间就形成了丝绸之路，用于商业之用，南北城市之间已广泛通商，通往青藏高原有‘茶马古道’，这些途径促进了商品交流，也对果树南北、东西之间流通发挥了积极作用。于是，原产于高纬度的抗寒种质被带入低纬度，使低纬度地区出现抗寒种质，原产于低纬度的种质同样被带入高纬度，但因被带入的地方冬季气温低，带入的种质可能出现2种情况：其一，不能适应低温而被淘汰，其二，发生突变而适应当地低温环境。所以，在对果树种质进行抗寒性评价时，应考虑到3个方面的因素，即遗传特性、环境影响与人为因素影响。本研究对来源于我国高海拔、西北高旱地区的28份地方桃品种及30份选育桃品种及品系的抗寒性展开评价，对试验结果以上述3个因素为依据进行分析。

图2 基于58份桃种质半致死温度的聚类分析系谱图

种质y=k/(1+ae-bt)LT50/℃拟合度R2种质y=k/(1+ae-bt)LT50/℃拟合度R22010西藏17号 y=100/(1+611.18e-0.37t)-17.310.881**沪油004 y=100/(1+4250.69e-0.26t)-32.150.812**2010西藏54号 y=100/(1+5517.08e-0.46t)-18.660.896**瑰玉 y=100/(1+3.99e-0.04t)-32.280.774**2010西藏32号 y=100/(1+1117.32e-0.31t)-23.000.9**瑞光28号 y=100/(1+64.30e-0.13t)-32.330.851**2010西藏28号 y=100/(1+189.90e-0.22t)-24.240.822**锦香 y=100/(1+60098.85e-0.34t)-32.430.773**秋露 y=100/(1+16.59e-0.10t)-27.610.71**临黄1号 y=100/(1+88.86e-0.14t)-32.770.734**光核桃(阿坝) y=100/(1+79.63e-0.16t)-27.970.71**霞晖8号 y=100/(1+390.81e-0.18t)-32.780.748**中油金铭 y=100/(1+152.44e-0.18t)-280.851**金露 y=100/(1+64.25e-0.13t)-32.830.823**隆盛蟠桃 y=100/(1+419.34e-0.22t)-28.080.65*秦家湾早桃y=100/(1+5237.05e-0.261t)-32.940.724**金霞油蟠桃 y=100/(1+65.97e-0.15t)-28.120.79**沪油002 y=100/(1+2842.70e-0.24t)-32.990.719**叶县黄肉桃 y=100/(1+563.12e-0.23t)-28.140.639*中农金辉y=100/(1+22.47e-0.09t)-33.110.688*春蜜 y=100/(1+486.57e-0.22t)-28.180.881**秦蜜 y=100/(1+2140.05e-0.23t)-33.190.704*吐-2 y=100/(1+445.20e-0.21t)-28.550.645*中油8号 y=100/(1+152.05e-0.15t)-33.430.801**西庄1号 y=100/(1+1086.99e-0.24t)-28.590.753**金塔红光 y=100/(1+29.94e-0.10t)-33.480.69*墨玉8号y=100/(1+2353.49e-0.27t)-28.900.924**霞脆 y=100/(1+431.80e-0.18t)-33.50.841**黄艳y=100/(1+5.18e-0.06t)-28.940.866**中蟠桃10号 y=100/(1+19.87e-0.09t)-33.510.916**中油13号y=100/(1+64.29e-0.14t)-29.480.746**锦园 y=100/(1+304.89e-0.17t)-33.90.795**隆盛大晚桃 y=100/(1+142.21e-0.17t)-29.760.691*江村1号 y=100/(1+199.855e-0.16t)-33.950.847**春艳 y=100/(1+87.91e-0.15t)-30.010.755**隆盛新疆桃 y=100/(1+103.90e-0.14t)-34.220.841**南方金蜜 y=100/(1+42212.43e-0.35t)-30.340.857**瑞蟠21号 y=100/(1+24.85e-0.09t)-34.270.82**塔园粘核桃y=100/(1+213.50e-0.18t)-30.440.885**霞晖6号 y=100/(1+68.02e-0.12t)-34.720.647*曙光 y=100/(1+1206.93e-0.23t)-30.510.867**瑞光33号 y=100/(1+146.58e-0.14t)-34.740.878**中蟠桃11号y=100/(1+18.47e-0.09t)-30.760.824**月牙红李光 y=100/(1+1073.77e-0.20t)-34.760.708*丁家坝红李光 y=100/(1+17.535e-0.09t)-30.910.754**中油12号 y=100/(1+7.14e-0.06t)-34.780.778**下庙1号y=100/(1+837.39e-0.21t)-31.340.615*沪油018 y=100/(1+13.94e-0.07t)-35.20.797**秋月 y=100/(1+1.15e-0.004t)-31.40.843**春元 y=100/(1+97.80e-0.13t)-35.700.697*南山1号 y=100/(1+17.46e-0.09t)-31.690.775**红光晚李光桃 y=100/(1+46.58e-0.11t)-35.740.681*龙2-4-6 y=100/(1+89.81e-0.14t)-31.780.717**夏至早红 y=100/(1+6.19e-0.05t)-38.500.733**中桃红玉 y=100/(1+141.58e-0.16t)-31.940.874**江村4号 y=100/(1+2.98e-0.03t)-39.430.718**伊犁县黄肉桃y=100/(1+55.55e-0.13t)-32.090.729**丁家坝青皮桃 y=100/(1+5.41e-0.04t)-44.130.758**

本研究中，来源于青藏高原桃区的地方品种，抗寒性在所有参试品种中最低。这和青藏高原平均海拔高、气温低的环境特性相悖，作者认为可能和当地的局域性小气候有关。测试品种的所在地‘林芝’，西、北、东三方向有喜马拉雅山、念青唐古拉山、横断山脉相连接，仅东南方向形成一个出口，印度洋、太平洋暖流循口而入，形成特殊的亚热带气候，年均气温较高，该生长环境极有可能造就了当地桃地方品种较弱的抗寒性。来源于西北高旱桃区的地方品种，抗寒性具有一种特殊现象：纬度更高、更靠北的一些品种，抗寒性较纬度较低、更靠南的品种更低，相反，一些纬度相对较低的品种，其抗寒性表现出极强的特性。这至少说明两点：第一，更靠北的地区的冬季最低气温，至少在抗寒性较差的品种的半致死温度范围之内。第二，纬度更高、更靠北的抗寒基因可能流入纬度较低、更靠南的地区，使该地区出现抗寒性较强的地方品种。作者认为这种流入可能和人为因素有关，因为‘丝绸之路’在两千多年前就已经形成，而本次测试的品种都在丝绸沿线或附近，这使得源自于高纬度的抗寒品种，极有可能被商旅带回到纬度相对较低的地区，从而使这些地区出现抗寒性高的地方品种。所有测试的选育品种及品系，抗寒性强的占66.8%，表明抗寒基因在多数选育品种及品系中已有效积累，同时也说明抗寒性已作为一个主要性状被育种工作者所重视。

对于大多数测试品种而言，-21℃可作为细胞膜开始受损伤的临界温度，-21～-30℃，细胞膜损伤程度加大，超过此范围，细胞膜损伤将不会被修复。通过抗寒性评价，筛选出3个高抗资源。