纺织品中双酚A检测用表面等离子体共振传感器的表面预处理

李正海， 刘 芳， 黄 珏， 薛文良， 钱竞芳

(1. 东华大学 纺织面料技术教育部重点实验室， 上海 201620； 2. 佛山中纺联检验技术服务有限公司，广东 佛山 528000； 3. 中华人民共和国上海海关， 上海 200120)

双酚A(BPA)在纺织服装生产过程中常充当显色剂，被广泛应用于变色功能纺织品的热敏变色印花上[1]，但BPA是一种环境激素，在长期与皮肤密切接触时可导致人体内分泌失调，致使生殖功能下降，并且对胚胎具有一定的致畸性和毒性，存在诱发体内细胞癌变的风险[2]。在经济全球化的时代背景下，进出口服装的质量安全问题也备受各个国家的关注。加拿大是世界上首个将BPA列为有毒化学物质的国家，宣布将控制BPA 的使用[3]。

表面等离子体共振(SPR)现象是一种基于折射率变化的物理光学现象[4]。当偏振光入射角超过临界角时会发生全反射，在金属膜中产生消逝波，偏振光被耦合入表面等离子体内，界面上的等离子体就会与消逝波发生共振，即SPR原理[5-6]。SPR技术由于检测过程方便快捷、无需精度提纯、特异性识别度高、可实时监测等优点，已经在医学诊断、化学检测、生物技术、食品安全等众多领域得到了应用，并且正逐渐地向消费品检测领域扩展。在使用SPR技术直接检测时，通常只有相对分子质量高于2 000的物质产生的共振才能得到相对显著的SPR信号。但双酚A相对分子质量很小，仅为228，且纺织品中双酚A的含量相对较低，直接采用SPR技术检测低浓度的双酚A几乎难以得到响应信号，因此需要对传感器芯片进行修饰以得到放大信号来实现高灵敏度检测。

目前传感器芯片常用的修饰方法有直接吸附法、金属螯合法、共价偶联法、亲和素-生物素结合法等[7]。在对纺织品中BPA的检测研究中，可利用BPA-琥珀酰亚胺酯和BPA-卵清蛋白偶联物来对传感器芯片进行电修饰，但该方法检测过程复杂，偶联物修饰不稳定，检出限低[8]。此外，有研究者分别利用TiO2/Au 复合膜酪氨酸酶和卡那霉素分子印迹技术等方式对芯片表面进行预处理，但该方法对纳米TiO2材料、交联剂和引发剂的要求较高，使得检测成本过高[9-10]。本文利用BPA-牛血清蛋白抗原(BPA-BSA)与双酚A抗体的特异性结合原理，采用SPR技术竞争法检测纺织品中的双酚A，以探索芯片在检测前期进行BPA-BSA的修饰方法及最佳修饰条件。

1 竞争法检测双酚A原理

用SPR进行小分子物质竞争检测时存在图1所示的2种不同方式来提高信号的强度：一种是2个待测物竞争传感器表面的同一抗原，即表面竞争；另一种是待测物和传感片上固定的物质竞争溶液中的抗原，即溶液竞争[11]。

图1 SPR竞争法的2种方式Fig.1 SPR competition in two ways

将具有特异性吸附属性的生物蛋白抗原通过一定的技术固定于金属膜表面后，依据反应的响应程度来判断溶液中被分析物与该抗原的结合的动力学过程[12]。当目标物流过经固定抗原后的金膜表面时，便可与抗原产生特异性结合，从而共振使反射光谱发生变化，将结合物分子量的变化以光学信号的形式反映出来，实现实时传感检测；因此，作为实验第1步芯片的表面修饰就显得极其重要。本文将探索在溶液竞争法检测纺织品中BPA过程中传感芯片的选择、修饰和抗原固定的最佳实验条件。经修饰后的芯片可与抗原进行共价键结合，有效消除抗原的非特异性吸附，从而很大程度上提高了SPR分析灵敏度。

2 实验部分

2.1 实验仪器

H-SPR表面等离子体共振仪。

传感芯片：羧甲基葡聚糖组装(CM5) 芯片、裸金芯片(Au)。

2.2 实验溶液的配制

2.2.1芯片修饰溶液

2-吗啉乙磺酸(MES)溶液：质量浓度为0.009 76 g/mL，pH值为6.0。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐(EDC)溶液：质量浓度为0.003 875 g/mL，溶剂为MES溶液。

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液：质量浓度为0.004 34 g/mL，溶剂为MES溶液。

乙醇胺-盐酸溶液：浓度为1 mol/L，pH值为8.5。

11-巯基十一烷酸(11-MUA)的乙醇溶液：质量浓度为0.00 109 g/mL，溶剂为无水乙醇。

2.2.2测试溶液

醋酸盐缓冲液：取4.9 mL浓度为0.2 mol/L的醋酸钠溶液和5.1 mL浓度为0.2 mol/L的醋酸溶液进行混合，用三级水和氢氧化钠溶液将混合溶液浓度调至0.01 mol/L，pH值为4.5。

双酚A-牛血清白蛋白(BPA-BSA)溶液：将购买的BPA-BSA原溶液用醋酸盐缓冲液稀释至100 μg/mL，备用。

2.3 实验步骤

2.3.1芯片修饰原理

本文实验分别使用裸芯片(Au)和具有一层羧甲基葡聚糖修饰CM5芯片。由于裸芯片表面没有羧甲基葡聚糖，故需对其表面进行羧化。羧化后的裸芯片和CM5芯片一样具有羧甲基葡聚糖，待测物的BSA偶联物会因共价键的极性作用与葡聚糖表面进行结合，如图2所示。

图2 芯片修饰氨基偶联示意图Fig.2 Schematic diagram of amino-coupling of chip modified

2.3.2裸芯片修饰步骤

1)取全新裸芯片，用1 mmol/L的11-巯基十一烷酸(11-MUA)溶液浸没，在4 ℃条件下浸泡12 h；

2)取出裸芯片，用灭菌三级水清洗，随后用N2吹干；

3)将芯片放入SPR仪中，通入灭菌三级水，设置流速为300 μL/min，得到稳定基线；

4)通入EDC和NHS(体积比为1∶1)300 μL，设置流速为20 μL/min，使传感片表面的羧基活化为酯基；

5)通入300 μL BPA-BSA偶联物溶液(醋酸盐溶液稀释，pH值为4.5，浓度为0.01 mol/L)，设置流速为20 μL/min；

6)通入100 μL pH值为8.5的乙醇胺-盐酸(MUA)溶液，设置流速为20 μL/min，封闭未反应的活化羧基官能团。

2.3.3CM5芯片修饰步骤

全新CM5芯片表面已修饰了羧甲基葡聚糖，存在稳定Au—S键，故只需进行2.3.2节中3)～6)步骤。

3 结果分析

3.1 不同芯片修饰后溶液测试曲线

取CM5芯片和经羧化后的裸金芯片分别放入SPR仪，调节室温至25 ℃，调节流池流速为20 μL/min，具体步骤如下：1)通入醋酸盐缓冲溶液，直至基线稳定；2)通入某一浓度的BPA-BSA偶联物溶液(醋酸盐溶液稀释，pH为4.5)300 μL，设置流速为20 μL/min；3)通入醋酸盐缓冲溶液5 min清洗芯片。该反应采用国际单位RU来衡量：1 RU=1 pg蛋白/mm2=1×10-6RIU(折射指数单位)。图3示出质量浓度为40 μg/ mL的BPA-BSA溶液的吸附响应曲线。由于BPA-BSA溶液的浓度不同，使得在芯片上与酯基反应的氨基数量也不同，引起的RU响应值也不同(②段和①段RU的差值)。

①段为通入缓冲液基线稳定阶段；②段为通入的BPA-BSA偶联物溶液反应阶段；③段为通入醋酸盐缓冲溶液清洗阶段。图3 2种修饰后芯片的BPA-BSA溶液测试曲线Fig.3 Test diagram of BPA-BSA solution of two modified chips

由图3可知，CM5芯片由于自身金膜上已修饰羧甲基葡聚糖，故而在反应中，曲线稳定，响应值明显。裸芯片经11-巯基十一烷酸(MUA)修饰后，表面虽覆有羧甲基葡聚糖，但在同样的反应条件下，所得曲线不太稳定，存在上下浮动。故在对芯片进行修饰时，CM5芯片比裸芯片更为稳定，为保证后续实验数值的稳定性，将选用CM5芯片进行实验操作。

3.2 不同pH值缓冲液的溶液测试曲线

将BPA-BSA固定在CM5型传感片上时，还需考察静电吸附等因素。BSA的等电点是4.9，而通常溶液的pH值在3.0～4.9之间时，最有利于BPA-BSA的吸附。本文实验中考察了pH值在3.5～6.0之间时，BSA在CM5传感片上的静电吸附行为。用醋酸和NaOH调节偶联物溶液的pH值，以0.5为pH值梯度分别配制pH值为6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5的BPA-BSA溶液。使用全新的CM5芯片，通入25 μL醋酸盐缓冲液来获取实验基线，设置流速为5 μL/min，再依次通入上述pH值的BSA-BSA溶液样品各2 min，响应曲线如图4所示。

图4 不同pH值抗原溶液固定响应图Fig.4 Response diagram of antigen solution at different pH values

由图4可知：由于pH值为6.0、5.5时，高于BSA的等电点，使得BSA带负电，所以吸附作用极弱；而在pH值为5.0时，BSA略带负电，但仍然能在CM5传感片上有较强的吸附行为(RU响应增加)；当pH值为4.5时，吸附量达到最大。通常可采取降低溶液pH值的方法来增强静电吸附，因此，选取固定BSA溶液的pH值为4.5。

3.3 不同离子强度缓冲液的溶液测试曲线

醋酸钠缓冲液在实验中不仅能为BSA提供酸性环境，还能最大限度地激发抗原的活性，使特异性结合得更加牢固。本文实验使用的BPA-BSA醋酸钠溶液的质量浓度为27.22 g/L，pH值为4.5，再用NaCl溶液调节离子浓度分别为100、50、10 mmol/L的BPA-BSA溶液。使用全新的CM5芯片，通入100 μL三级水来获取实验基线，设置流速为20 μL/min，再分别通入不同离子浓度的偶联物样品，响应图如图5所示。

图5 不同离子浓度抗原溶液固定响应图Fig.5 Response diagram of antigen solution at different ion concentrations

由图5可看出：当离子强度分别为100、50、10 mmol/L的BPA-BSA溶液通入流池后，结合量的响应值分别为25、35、102 RU；随着离子浓度的降低，吸附响应值越明显，当离子浓度为10 mmol/L时，吸附效果最好。

3.4 不同浓度BPA-BSA的吸附响应曲线

为了使抗原蛋白能在最大程度上固定到芯片传感器表面，本文对不同浓度的BPA-BSA进行了实验。选取前述最佳离子浓度为10 mmol/L、最佳pH值为4.5的醋酸盐缓冲溶液，配制质量浓度分别为20、30、40、50、60、70、80 μg/ mL的BPA-BSA偶联物溶液。使用全新的CM5芯片，通入100 μL醋酸盐缓冲液来获取实验基线，设置流速为20 μL/min，随后依次通入上述不同浓度的BPA-BSA偶联物样品各5 min，响应图如图6所示。

图6 不同浓度的BPA-BSA溶液对应的相对响应图Fig.6 Response diagram of BPA- BSA solution at different concentrations

由图6可知：当BPA-BSA溶液的质量浓度低于30 μg/ mL时，相对响应值随着质量浓度的增加而不断增大；当BPA-BSA溶液的质量浓度在30～50 μg/mL之间时，相对响应增势放缓；当BPA-BSA溶液的质量浓度大于50 μg/ mL时，相对响应几乎不再变化，只在一定的范围内波动。故BPA-BSA溶液的最佳质量浓度可确定为50 μg/ mL。

4 结束语

本文建立了纺织品中双酚A溶液竞争法检测前芯片的氨基偶联预处理方法。该方法与传统的双酚A检测前处理方法相比，特异性识别度高，避免了其他杂质对实验的影响，可在纺织品双酚A检测前处理中予以应用。

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