肾复康Ⅱ号对MSCs旁分泌作用的实验研究*

张晓凤 ，田 耘 ，程小红，赵亚峰，刘建红，张 鹏 ，张 宇，宋阿苗，徐长青

1陕西省中医医院，陕西 西安 710003；2咸阳职业技术学院

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新、多系分化和高度增殖的细胞，近年来人们逐渐将其应用于多种疾病的治疗［1］。目前越来越多的研究证实，移植后MSCs旁分泌功能是其发挥治疗作用的主要机制。Dzau最早证实MSCs以旁分泌方式发挥心肌损伤修复作用［2］。研究发现，将MSCs移植到肾间质纤维化的动物模型中，MSCs通过分泌各种细胞因子促进肾小管周围细胞增殖，减轻炎症反应，抑制细胞凋亡，参与肾脏结构和功能的恢复，抑制肾间质的纤维化［3］。上述研究虽然证实了移植后MSCs以旁分泌功能抑制肾间质纤维化，并为临床治疗肾间质纤维化提供了新的思路，但是MSCs移植后生存率低，细胞移入后旁分泌能力差仍是目前MSCs移植领域尚未解决的难题［4］。我们的前期研究发现，肾复康Ⅱ号对单侧输尿管梗阻大鼠具有减少转化生长因子 β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和纤溶酶原激活物抑制剂1（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）表达，促进肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、骨形态发生蛋白 -7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）增殖和生长的作用［5-6］。又有研究显示HGF及其受体c-Met是调控MSCs旁分泌功能的重要因子，可以通过影响多种细胞因子，如TGF-β1、α平滑肌肌动蛋白等抑制肾间质纤维化［7］。结合上述研究结果，我们采用肾复康Ⅱ号联合MSCs移植的方法尝试解决改善MSCs旁分泌作用的科学难题。本研究采用将肾复康Ⅱ号联合MSCs移植、肾复康Ⅱ号联合NK4拮抗MSCs表面的HGF后再移植的方法，观察MSCs的旁分泌作用，为揭示肾复康Ⅱ号对MSCs的旁分泌调控作用与机制提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 肾复康Ⅱ号 严格按照我院院内制剂制备工艺执行（陕药制字Z20130011）：将山茱萸120 g、山药（炒）80 g粉碎成细粉，将菟丝子120 g，熟地黄 80 g，金樱子 96 g，淫羊藿 80 g，丹参 120 g，赤芍 96 g，姜黄 96 g，黄芪 120 g，王不留行 120 g，鳖甲（醋制）120g加水煎煮2次，2 h/次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为 1.32～1.38（60～65℃）的稠膏，加入上述细粉、混匀、干燥、粉碎，用75%的乙醇制成颗粒，干燥即可。

1.1.2 动物 雄性1周龄SD大鼠3只，体质量约25 g，制备MSCs；雄性体质量约250 g成年SD大鼠50只制备动物模型。购自西安交通大学动物中心，实验动物合格证号：SCXK（陕）2016-0816。

1.1.3 仪器与试剂 二氧化碳培养箱（Thermo Scientific 公司，批号：3131），L-DMEM 培养基、进口胎牛血清（美国Gibco公司，批号31600034，1616000-084），HGF鼠单抗、C-Met鼠单抗（英国Abcam公司，批号：201616，201689）、NK4 蛋白转染质粒（长沙赢润生物技术有限公司，批号：2016100412），反转录试剂盒、SYBR real-time PCR试剂盒（日本 Takala 公司，批号：1621，1689）等。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 随机将50只SD大鼠分为模型组、生理盐水组+MSCs移植组（生理盐水+MSCs组）、生理盐水组+NK4拮抗HGF表达的MSCs组（生理盐水+拮抗剂组）、肾复康Ⅱ号+MSCs移植组（肾复康Ⅱ号+MSCs组）、肾复康Ⅱ号+NK4拮抗HGF表达的MSCs组（肾复康Ⅱ号+拮抗剂组）。应用不同药物混悬液预处理，分别给予生理盐水灌胃、肾复康Ⅱ号混悬液灌胃，1次/d，共14天。

1.2.2 M SCs的分离、纯化和培养 1周龄雄性SD大鼠3只，颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，于超净台中无菌条件下分离股骨、胫骨，剪去两侧骨骺端，吸引无血清培养基冲出骨髓，反复数次，每分钟1 000 rpm，离心5分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入10%胎牛血清培养基，制成单细胞悬液，以1×106/cm2的密度接种于25 cm2的培养瓶中，置于 5%CO2，37℃孵箱中培养，常规换液、传代［8］。

1.2.3 造模方法 大鼠肾间质纤维化模型的制备采用单侧输尿管结扎法［4］。造模后1天，模型组尾静脉注射生理盐水1 mL，其余各组尾静脉注射 2×106/100 μL 的 MSCs。

1.2.4 PCR检测N K 4拮抗M SCs H G F的表达 用TRIzol裂解各组细胞，提取总RNA。测量RNA浓度，用紫外分光光度计进行RNA浓度测量。用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，用SYBR real-time PCR试剂盒配置20μL反应体系。将配置的PCR反应溶液置于Real-time RNA仪进行荧光定量PCR实验。

1.2.5 PCR检测H G F及C-M et的表达 移植后4周，颈椎脱臼处死大鼠，分离双侧肾脏，将肾组织匀浆后备用。应用Trizol法提取大鼠肾脏总RNA，实时定量-逆转录聚合酶链反应进行基因片段扩增并定量。PCR反应各管所加模板RNA量约为2 μg。通过Real-time RNA仪进行荧光定量PCR实验，Ct值对起始模板相对定量。

1.2.6 W est ern bl ot检测H G F及C-M et的表达 肾组织匀浆后用Trizol法提取蛋白，进行蛋白定量，电泳分离蛋白，电转移至NC膜上，分别加入特异性抗体、二抗浓度为1∶1000，快速化学发光法显影，多色荧光凝胶成像系统定量扫描光密度，以β-actin为参照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0医学统计软件包进行统计学处理，定量资料采用（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 N K 4拮抗 M SCs H G F、c-M et的表达 应用NK4蛋白转染质粒干预MSCs，转染24小时后进行实时定量PCR检测，发现HGF拮抗剂NK4可抑制MSCs的HGF表达，见图1。

2.2 H G F及c-M et的表达 移植后4周，Western blot结果显示，肾复康Ⅱ号+MSCs组较其余各组肾组织HGF及c-Met均明显增高，肾复康Ⅱ号+MSCs组升高最明显，其次为肾复康Ⅱ号+拮抗剂组、生理盐水+MSCs组，见图2。

图1 2组N K 4拮抗M SCs H G F、c-M et的表达

图2 各组大鼠移植后H G F及c-M et的表达

2.3 H G F及c-M et的表达 移植后4周，实时定量PCR结果显示，肾复康Ⅱ号+MSCs组较其余各组肾组织HGF及c-Met均明显增高，肾复康Ⅱ号+拮抗剂组与生理盐水+MSCs组肾组织HGF及c-Met升高程度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组肾组织中的H G F、c-M et m RN A的表达（±s） β-act i n

表1 各组肾组织中的H G F、c-M et m RN A的表达（±s） β-act i n

注：*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 H G F c-M et模型组 1.20±0.21 1.20±0.14生理盐水+拮抗剂组 1.29±0.18 1.36±0.12生理盐水+M SCs组 1.66±0.11 1.65±0.12肾复康Ⅱ号+拮抗剂组 1.76±0.13 1.67±0.14肾复康Ⅱ号+M SCs组 1.94±0.07* 1.93±0.12*

3 讨论

慢性肾脏病具有发病率高、病程进展快、医疗费用高等特点，严重危害人类健康［9］。慢性肾脏病的主要病理特征是肾脏纤维化，肾脏纤维化是多种肾脏疾病发展至终末期肾功能衰竭的共同通路。因此，要延缓慢性肾脏病的进展，势必以防治肾脏纤维化作为突破口［10］。

间充质干细胞因其具有自我更新、多系分化、高度增殖、易于分离培养扩增、移植时不存在组织配型、无免疫排斥及伦理问题等特性，逐渐成为细胞移植和组织工程中的理想种子细胞［1］。研究认为MSCs定向分化为新的组织细胞替代受损组织是其发挥治疗作用的主要方式［3］。2005年MSCs旁分泌功能的证实［2］，使越来越多的观点认为移植后MSCs旁分泌细胞因子是其发挥治疗作用的主要机制［4］。多数观点认为，MSCs归巢至受损组织以旁分泌方式起作用抑制肾间质纤维化是发挥治疗作用的主要机制。目前，有文献报道的MSCs分泌的细胞因子中，HGF被证实在调控MSCs旁分泌功能抑制肾间质纤维化中起重要作用。HGF通常由间质来源的细胞分泌，可作用于数种上皮起源的细胞，诱导其进行有丝分裂、刺激细胞移动，并促进其入侵细胞基质［11］。HGF与受体c-Met结合引起酪氨酸激酶活化，激活细胞内多个信号级联反应［12］。HGF拮抗剂中最具代表性的是NK4。NK4与c-Met结合可以竞争性的完全抑制HGF和c-Met的相互作用，从而抑制HGF所诱导的细胞增殖、运动和形态生成［13］。

然而，MSCs治疗过程中旁分泌能力差是影响其疗效的瓶颈问题。虽然，近年来已进行了很多有关改善MSCs归巢和旁分泌功能的研究，如基因转染、诱导细胞因子表达等［14］，但是都未能完全解决影响移植后MSCs疗效的根本问题。因此，国内不少学者应用中药单体或复方联合MSCs移植的方法提高MSCs的旁分泌作用［15-16］。

肾纤维化属中医“肾劳”范畴，我科在临床治疗肾纤维化过程中提出肾阳虚损，痰瘀互结为其基本病机，以益肾散结立法，组方肾复康Ⅱ号，干预肾间质纤维化的进展，已取得了较满意的疗效。近年来我们对该方进行的相关实验研究证实，肾复康Ⅱ号具有改善UUO大鼠肾功能，减少TGF-β1和PAI-1的表达，促进HGF、BMP-7表达，上调MSCs分泌的HGF的表达，提示该方具有促进MSCs分泌抗纤维化因子抑制肾纤维化的作用［17］。

因此，本研究发现肾复康Ⅱ号联合NK4抑制MSCs-HGF表达后再移植，在肾组织中仍能分泌HGF蛋白，证明肾复康Ⅱ号具有促进MSCs在体内分泌HGF的作用，从而验证了肾复康Ⅱ号对植入的MSCs具有旁分泌功能，并部分揭示了其调控机制。本实验为临床应用肾复康Ⅱ号协助MSCs移植抑制肾间质纤维化提供了研究基础。今后，还可能为阐明中药益肾散结配伍的科学内涵提供实验依据。