NMN在糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化中的作用及其机制

2018-11-28王曼伊农琳琳翟晓雅冯乐平

吉林大学学报（医学版） 2018年6期

崔奇，王曼伊，农琳琳，翟晓雅，冯乐平

(1．桂林医学院公共卫生学院食品卫生与营养教研室，广西桂林 541004；2.桂林医学院第一附属临床医院优生优育科, 广西桂林 541004； 3.桂林医学院基础医学院实验教学中心,广西桂林 541004)

叉头转录因子3a(Forkhead box O3a，FoxO3a)作为FoxO家族成员之一，通过调控下游靶基因，在细胞凋亡、自噬、氧化应激、细胞分化和细胞代谢等过程中发挥重要作用[1-4]。p-FoxO3a能够通过细胞凋亡和细胞自噬作用[5]促进成纤维细胞凋亡和自噬，以及抑制上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)基因表达[6]，从而减缓组织纤维化进程。研究显示:沉默信息调节因子1(silent information regulator,Sirt1)能够导致p-FoxO3a去乙酰化，上调p-FoxO3a表达，进而阻止氧化应激对组织细胞带来的损伤；p-FoxO3a也同样受到蛋白激酶B(AKT)在不同位点的磷酸化调控，从而在调节细胞凋亡和抵抗氧化应激等方面发挥作用。本文作者采用动物模型和高糖浓度培养肾小球系膜细胞(HBZY-1)对糖尿病引起的肾实质细胞炎性-纤维化进行研究，通过烟酰胺单核苷酸(NMN)调控Sirt1和AKT，间接影响p-FoxO3a和小窝蛋白(caveolin-1,Cav-1)表达，阐明NMN减缓糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠肾脏纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 0.56 mmol·L-1DMEM培养基(Dulbecco公司，美国)，10%胎牛血清(Gemini公司，美国)，胰蛋白酶(工作液浓度0.25%)、青霉素和链霉素(终浓度分别为100 U·L-1和100 kg·L-1)(Solarbio公司，中国)，链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(Sigma-Aldrich公司，德国)，烟酰胺和NMN(Sigma 公司，美国),Sirt1单抗(Abcam公司，英国)，兔抗大鼠( Cav-1)单抗(Santa公司，美国)，抗大鼠AKT单抗(Bioword 公司，美国)，FoxO3a和p-FoxO3a单抗(Abcam公司，英国)，FITC标记的羊抗兔多抗和Cy3标记的羊抗兔多抗(LIFE公司，美国)。血糖诊断试剂盒(Omron公司，日本)，GT-1640血糖检测仪(ARKRAY有限公司，日本)，Cobas111 全自动生化分析仪(Roche公司，美国)，LSM700激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss公司，德国)，Mini-PROTEAN 3 CELL 165-3301电泳系统和小型垂直电泳转印系统(Bio-Rad公司，美国)。

1.2 动物分组和给药 SD大鼠50只，雄性，体质量 200～250 g，由桂林医学院实验动物中心提供。大鼠于标准聚丙烯鼠笼中饲养，室温(23±1)℃，湿度50%～60%，12 h光/暗光照周期，1周后随机分为对照组(n=10，采用正常饮食，常规食物包括：脂肪5%、碳水化合物63%、蛋白质23%、总热值25 kJ·kg-1)和实验组(n=30，采用高脂肪饮食，高脂肪食物包括：脂肪32%、碳水化合物48%、蛋白质20%，总热值54.3 kJ·kg-1)。2组大鼠均采用灭菌的自来水作为饮用水。实验组大鼠平均体质量为(300±20)g，注射50 mg·kg-1STZ，以0.01 mmol·L-1冰镇柠檬酸缓冲液(pH 4.5)溶解，在30 min内通过腹腔注射。对照组大鼠使用柠檬酸盐缓冲液注射。随后从尾静脉中采集血液样本，用于葡萄糖水平测定，当空腹血糖水平持续达到16.7 mmol·L-1时，SD大鼠被认为是糖尿病模型大鼠。30只实验组糖尿病大鼠进一步随机分为糖尿病+NMN组和糖尿病+PBS组(每组15只)；糖尿病+NMN组大鼠静脉注射NMN(120 mg·kg-1)(NMN应用200 μL无菌磷酸盐缓冲液稀释)，每隔1 d在颈部和肩部松散组织皮下注射，持续20 d；糖尿病+PBS组大鼠皮下注射接种200 μL无菌PBS，每隔1 d在颈部和肩部松散组织皮下注射，持续20 d，之后断头处死大鼠，摘取肾脏进行组织切片和蛋白提取，分别用于目的蛋白免疫印迹分析及免疫共聚焦分析。本研究经桂林医学院实验动物伦理审查委员会批准。

1.3 细胞培养大鼠肾小球系膜HBZY-1细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所。细胞保存于正常浓度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)条件下，置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于体外37℃、5% CO2条件下适应性培养24 h，之后在高浓度葡萄糖(200 mmol·L-1)氧化应激条件下继续培养1～6 d，并隔天更换相同条件培养基。高浓度葡萄糖培养细胞按照给予NMN浓度的不同，随机分为0、50、100和200 μmol·L-1NMN组，并设对照组(未加入高浓度葡萄糖)，继续培养24 h后收集细胞，提取蛋白用于相关目的蛋白的免疫印迹分析。

1.4 免疫共聚焦法检测大鼠肾小球细胞中Sirt1、AKT、p-FoxO3a和Cav-1蛋白表达水平 4%多聚甲醛固定大鼠肾组织，脱水后石蜡包埋并切片，组织切片经脱蜡和乙醇梯度脱水，枸橼酸微波修复后，加待检蛋白一抗：抗 Sirt1(1∶500)、AKT(1∶1 000)、p-FoxO3a(1∶1 000)和Cav-1(1∶400)单抗进行孵育，4℃冰箱静置过夜，加入相应荧光标记的二抗(1∶1 000)，37℃避光孵育 1 h；采用 PBS洗涤 3 次，DAPI 避光染色5 min ，N-丙基没食子酸盐(N-propyl gallate，NPG)(抗荧光淬灭剂)处理后树脂胶封片，共聚焦显微镜下检测大鼠肾小球细胞质和细胞核中Sirt1、AKT、p-FoxO3a和Cav-1蛋白表达水平。绿色荧光代表肾小球细胞中AKT和p-FoxO3a表达，红色荧光代表肾小球细胞中Sirt1和Cav-1蛋白表达，采用 ImageJ 2×软件计算10个视野的平均荧光强度，以荧光强度表示单位面积蛋白表达水平。

1.5 Western blotting法检测HBZY-1细胞中Sirt1、AKT、p-FoxO3a和Cav-1蛋白表达水平将1 mL含1×106mL HBZY-1细胞悬液移至直径为35 cm的培养皿中，增加葡萄糖浓度至200 mmol·L-1，培养6 d后分别加入NMN，浓度分别为 0、50、100和200 μmol·L-1，继续培养细胞24 h后，收集并裂解细胞提取蛋白，采用Western blotting法检测高浓度葡萄糖条件下HBZY-1细胞中Sirt1、AKT和p-FoxO3表达水平。取出培养细胞加入细胞裂解液置于 Eppendorf 离心管中，超声波粉碎仪裂解蛋白，经4℃低温12 000 g、15 min离心取上清液；蛋白定量后行SDS-PAGE电泳，电压 120 V，PVDF 半干式转膜(电压150 V、60 min)，牛血清白蛋白封闭滤膜，加入待检蛋白一抗[Sirt1(1∶500)、AKT(1∶200)、p-FoxO3a(1∶1 000)和Cav-1(1∶600)]，4℃孵育过夜，次日加入相应二抗(1∶2 000)后孵育1 h，将 PVDF 膜置于凝胶成像系统中获取相应蛋白条带的积分吸光度(integrated absorbance，IA)值，计算蛋白相对表达水平。蛋白相对表达水平=目标蛋白的IA值/β-actin的IA值。

2 结果

2.1 2组大鼠肾实质细胞中Sirt1和AKT蛋白表达水平免疫共聚焦检测结果显示：与糖尿病+PBS组比较，糖尿病+NMN组大鼠肾小球体积相对较小，细胞排列比较密集，且杂乱无章。糖尿病+NMN组大鼠肾脏实质细胞中Sirt1(红色荧光)表达水平明显高于糖尿病+PBS组(P<0.01)，糖尿病+NMN组大鼠肾实质细胞中AKT(绿色荧光)表达水平亦高于糖尿病+PBS组(P<0.01)。见图1(插页二)和2。

*P<0.01 compared with diabetes+PBS group.

Fig.2 Expression levels of Sirt1 and AKT proteins in renal parenchymal cells of rats in two groups

2.2 2组大鼠肾实质细胞中Sirt1和p-FoxO3a蛋白表达水平与糖尿病+PBS组比较，糖尿病+NMN组大鼠肾实质细胞中Sirt1(红色荧光)蛋白表达水平明显升高(P<0.01),且大鼠肾实质细胞中p-FoxO3a表达(绿色荧光)水平亦明显升高(P<0.01)。免疫共聚焦检测结果显示：肾小管细胞中p-FoxO3a蛋白表达(绿色荧光)在肾小管细胞中的分布多于肾小球细胞，说明肾小管细胞中p-FoxO3a蛋白表达多于肾小球细胞。见图3(插页三)和4。

*P<0.01 compared with diabetes+PBS group.

图4 2组大鼠肾实质细胞中Sirt1和p-FoxO3a蛋白表达水平

Fig.4 Expression levels of Sirt1 and p-FoxO3a proteins in renal parenchyma cells of rats in two groups

2.3 2组大鼠肾实质细胞中p-FoxO3a和Cav-1蛋白表达水平免疫共聚焦检测结果显示：与糖尿病+PBS组比较，糖尿病+NMN组大鼠肾小管和肾小球细胞中p-FoxO3a蛋白(绿色荧光)表达水平明显升高(P<0.01)，肾小管和肾小球细胞中Cav-1蛋白表达水平亦明显升高(P<0.01)。见图5(插页三)和6。

*P<0.01 compared with diatetes+PBS group.

图6 2组大鼠肾脏实质细胞中p-FoxO3a和Cav-1蛋白表达水平

Fig.6 Expression levels of p-FoxO3a and Cav-1 proteins in renal parenchyma cells of rats in two groups

2.4 各组HBZY-1细胞中SIRT1、AKT和p-FoxO3a蛋白表达水平 Western blotting 检测结果显示：200 mmol·L-1葡萄糖处理HBZY-1细胞72 h后，分别加入不同浓度(0、50、100和200 μmol·L-1)NMN处理24 h，与对照组(未经200 mmol·L-1葡萄糖处理)比较，50 μmol·L-1NMN组HBZY-1细胞中Sirt1和AKT蛋白表达水平升高(P<0.05)，100和200 μmol·L-1NMN组HBZY-1细胞中Sirt1和AKT蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与对照组比较，50 μmol·L-1NMN组HBZY-1细胞中p-FoxO3a蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但100和200 μmol·L-1NMN组HBZY-1细胞中p-FoxO3a蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图7和8。

2.5 不同浓度葡萄糖培养的HBZY-1细胞中AKT和Sirt1蛋白表达水平采用正常浓度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)和高浓度葡萄糖(200 mmol·L-1)分别处理HBZY-1 细胞，随后应用NMN分别干预24 h。在正常葡萄糖浓度或高浓度葡萄糖培养条件下，细胞中AKT与Sirt1蛋白表达水平均较对照组(5.6 mmol·L-1葡萄糖+0 μmol·L-1NMN)明显升高(P<0.01)，说明NMN在调节细胞表达内源性AKT与Sirt1过程中发挥重要作用。见图9和10。

3 讨论

p-FoxO3a蛋白在应对氧化应激时具有双重作用，当细胞发生氧化应激时，细胞处于胰岛素抵抗状态，细胞中的PI3K/AKT信号传导途径受阻，细胞质中大量p-FoxO3a蛋白集聚到细胞核，参与诱导细胞凋亡[7]。p-FoxO3a蛋白是AKT分子下游能够启动自噬基因转录的主要分子，其过度表达能够启动细胞自噬，并且能够促使成纤维细胞分泌胶原明显减少，从而改善细胞炎症-纤维化过程[8-9]。有学者在基因序列分析时发现:Cav-1启动子基因内包含了几个p-FoxO3a结合位点，使p-FoxO3a牢固地绑定到Cav-1启动子区域，p-FoxO3a转录表达增加了Cav-1 mRNA和蛋白表达。研究[11]显示:通过改变AKT通路能够使p-FoxO3a蛋白激活，进而增强成纤维细胞自噬活性，促进胶原蛋白降解，可以促进肺部纤维化形成。而具有去乙酰化酶活性的沉默信息调节因子Sirt1能够使p-FoxO3a蛋白发生去乙酰化作用，并促使其进入细胞核进而调节细胞生长阻滞。然而，在氧化应激状态下，随着p-FoxO3a蛋白去乙酰化作用增强，p27kip1、Bim和MnSOD等基因表达水平升高，从而降低细胞中的活性氧水平，发挥抗凋亡作用。激活AKT轴能够通过抑制细胞自噬，促进特发性肺纤维化的成纤维细胞维持胶原蛋白形成的病理状态[12]，说明细胞凋亡是细胞纤维化形成的重要因素[6，13-14]。但p-FoxO3a蛋白在DN肾脏纤维化方面的调控作用尚不清楚。本研究结果表明：在机体处于糖尿病肾脏逐步纤维化过程中，肾小球和肾小管细胞中内源性Sirt1和AKT蛋白表达水平均明显降低。本课题组应用NAMPT的代谢产物NMN通过负反馈调节，在改善作为前炎症因子NAMPT表达的前提下，试图提高Sirt1蛋白的表达和活性，通过Sirt1-p-FoxO3a和AKT-p-FoxO3a对DN肾脏纤维化的相关基因发挥作用。本研究结果表明：SD糖尿病大鼠在应用一定量NMN后，肾小管和肾小球细胞中Sirt1和AKT蛋白表达水平均较未施加NMN的对照组明显升高。与此同时，糖尿病+NMN组大鼠肾细胞中p-FoxO3a和Cav-1蛋白表达水平也明显高于对照组。体外实验中，应用高浓度葡萄糖(200 mmol·L-1)处理 HBZY-1细胞后，再应用不同浓度NMN处理，细胞中AKT与Sirt1也均较未施加NMN组增加。本研究结果显示：当NMN浓度达100 μmol·L-1时，Sirt1与AKT蛋白表达水平均达到峰值，且均明显高于对照组，在相同高浓度葡萄糖糖浓度培养条件下，当NMN浓度进一步加大到200 μmol·L-1时，细胞中Sirt1与AKT蛋白表达水平均未见明显升高，说明NMN能够使糖尿病状态下大鼠肾小球和肾小管细胞中Sirt1与AKT蛋白表达水平升高，即NMN能够在高浓度葡萄糖氧化应激状态下使HBZY-1细胞中Sirt1与AKT蛋白表达水平明显升高。在此过程中，经NMN处理的细胞中 p-FoxO3a和Cav-1蛋白表达水平也出现明显升高趋势。共聚焦显微镜下显示：糖尿病大鼠肾小球明显变小，且肾小球内细胞排列杂乱无章，呈明显的纤维化状态，但给予NMN后大鼠肾小球形状明显比未施加NMN时规整，肾小球内细胞排列有序，说明NMN通过增加肾脏细胞表达Sirt1与AKT蛋白，间接激活了p-FoxO3a和Cav-1蛋白表达，从而在一定条件下改善了DN肾脏炎性纤维化过程。本实验结果充分说明了NMN能够通过Sirt1-p-FoxO3a和AKT-p-FoxO3a对DN肾脏纤维化的相关基因发挥作用。NMN既是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)前体物质，又是Nampt合成的底物。在正常情况下，Nampt是细胞合成DNA的关键限速酶[15]。然而，在机体处于氧化应激状态下，Nampt能够作为前炎症因子激活典型的炎症通路因子转录因子κB(NF-κB)，启动炎症-纤维化通路[16-17]。离体实验[18-19]结果表明：在200 mmol·L-1葡萄糖氧化应激条件下，50 μmol·L-1以上NMN即能够通过负反馈抑制内源性Nampt表达，同时在不影响NAD+形成的基础上，促进Sirt1和AKT蛋白表达水平升高[18-19]。本研究结果提示：NMN能够提高糖尿病大鼠肾小球细胞中内源性Sirt1与AKT的表达水平，并改善p-FoxO3a蛋白的表达和磷酸化状态，从而通过Cav-1改善肾脏细胞的炎症纤维化状态，提示NMN及其类似物可能在预防和治疗DN肾小球纤维化中发挥作用。有研究[20-21]进一步证明：在NMN的作用过程中，Sirt1蛋白能使p-FoxO3a的乙酰基迁移，使p-FoxO3a蛋白发生去乙酰化反应，从而上调p-FoxO3a蛋白与特定靶基因的DNA结合能力并增加其转录活性。Sirtuins是一种NAD+依赖性的去乙酰化酶，即Sirtuins的去乙酰化反应需要氧化性的NAD+参与[22]。内源性Sirt1蛋白通过加强p-FoxO3a蛋白诱导细胞周期阻滞，允许细胞具有更多时间来修复损伤的DNA，并消除自由基的危害[23]。本研究结果显示：在糖尿病大鼠肾脏实质细胞中, p-FoxO3a蛋白能够同时受到Sirt1和AKT蛋白的共同调控，这一结果提示NMN可能在DN肾小球炎症纤维化过程中发挥作用。