杨静华：探索生命编码的秘密

本刊记者 刘 佳

在蒙特利尔大学——结缘RNA生命起源学说

杨静华最早师从于著名的分子进化学家、蒙特利尔大学Bob Cedergren教授，从事催化核糖核酸（ribozyme）结构和功能的研究。1988年在Cedergren教授的推荐下认识了著名诺贝尔奖得主、哈佛大学Walter Gilbert教授，第一次了解到RNA生命起源学说并开始研究生命的编码过程。

杨静华介绍说，R N A生命起源学说的代表作是分子生物学先驱James Watson的专著The RNA World，其主要论点描述了从甲烷、碳、氢、氧、氮等还原性无机世界，过渡到含有生命组成单元核糖核苷、氨基酸等的原始有机世界，最后形成具有自身复制特征的双链RNA世界，完成了生命的最早编码过程。作为RNA生命起源的关键证据，是RNA可以完成自身复制所必须的催化功能。杨静华在Cedergren教授的指导下，完全用化学合成的方法制造了具有生物催化功能的RNA以及RNA/DNA的混合多聚物，发表了多篇重要论文，在此基础上提出了脱氧核糖酶或nucleozyme的概念并获得一系列美国专利（US5652094/6140491/6713456），完善了RNA生命起源学说。

在博士研究期间，杨静华积极组织和宣传近代史上中国同行在tRNA化学合成方面对人类进化领域的卓越贡献。20世纪六七十年代，中国举全国之力完成了tRNA全化学合成，这是人类进化史上最精彩的一段历史事实，特别是发生在西方宗教神学针对科学进化论的激烈博弈，要拿出“生命可以由无机分子化学合成”证据的时代，本来应该被西方进化学界热捧的重大事件，但由于“文化大革命”等特殊原因却很少被西方人提起。在杨静华的建议下，Cedergren教授特别邀请了中国遗传泰斗谈家桢夫妇访问加拿大，由杨静华陪同走访了众多分子进化领域同行，进行了多场次演讲，向西方介绍了中国在那段特殊时期“tRNA大会战”的原因和中国同行对人类进化理论的卓越贡献，特别是毛泽东主席在遗传学领域抛弃当时苏联李森科主义而选择接受西方的孟德尔学说的历史背景。

在1992年获得加拿大医学研究总署杰出青年奖的授奖仪式上

杨静华相信，生命现象的基础一定遵循热力学定律，他相信在探索生命现象的逻辑基础的时候，常常会发现生命科学中的一些无法解释的原始问题，而这些原始问题的答案往往具有重大的理论和现实意义。

在哈佛医学院——探寻RNA功能的演化

值得强调的是，人类作为现代生物的代表却是以蛋白质作为催化功能的，并没有看到RNA的催化作用。如果RNA起源学说是对的话，在现代生物体系应该可以找到原始RNA的催化作用。的确，1989年科罗拉多大学Tom Cech教授和耶鲁大学的Sid Altman教授，也都是鲍勃的好朋友，分别证明了tRNA和rRNA成熟过程由RNA催化，由此获得了诺贝尔化学奖。但是问题并没有得到满意的回答，在生命过程中最重要的信使核糖核酸(mRNA)中，却迟迟找不到催化RNA的踪影。

为了回答这个问题，杨静华在1992年拿到博士学位以后来到了哈佛医学院Bernado Nadal-Ginard教授实验室继续博士后的研究。经过深入研究以后，杨静华提出了由核小RNA U6/U4组成的复合体在mRNA成熟过程中起着催化作用的假说并拿出了有力证据，结果以第一作者发表在《科学》杂志上（Science 263:77,1994），从而确立了RNA在人类进化早期的催化功能，为RNA生命起源学说画上了完美的句号。

在哈佛大学——开启RNA编辑理论研究

然而，RNA生命起源学说与现代生命的细胞现状还是具有很大差距。尽管低等生物中确实存在大量进化初期负责编码的双链RNA，但哺乳类动物——至少人类细胞内没有发现双链RNA的存在。这是RNA生命起源学说的一个待解之谜，也是杨静华研究生涯中的下一个目标。

1994年，经过激烈竞争，杨静华来到了世界著名生物学家、哈佛大学细胞生物学系教授Tom Maniatis的实验室做研究员(Research Associate)。Tom是分子生物学领域的先驱，是DNA双螺旋发现者James Watson的弟子，著作有《分子克隆》，被誉为分子生物学的圣经，国内外分子生物学领域学生无人不知的工具书。来到实验室的第一天，Tom和他的铁搭档——也是杨静华的第二导师、2015年诺贝尔奖得主Richard Axel教授，甩给杨静华一个神经生物学中的难题，说“now it’s your problem（现在就是你的事了）”就离开了。

杨静华回忆说，导师提出的问题是这样的：人类DNA编码谷氨酸受体和实际测到cDNA序列总是不一样，基因编码的是腺嘌呤，而每次测到的却是鸟嘌呤。这个变化就像是一个开关，决定着人类谷氨酸受体的“开”或“关”。经过仔细研究，杨静华设计了一个巧妙的RNA链接方案，把可能变化的腺嘌呤标记上了同位素，通过实验解决了这一难题。

杨静华的研究表明，哺乳动物细胞中都存在着一种未报道过的生物活性，能够非常有效地把双链RNA中的腺嘌呤通过脱氨反应变成次黄嘌呤。这个重要结果发表在《自然》杂志上（Nature 374:77,1995）。现在，这个过程已经被定义为“RNA编辑”过程（RNA editing）。很快，杨静华克隆并测定了催化这个过程的酶，现在被定义为RNA编辑酶（ADAR1/2/3）。现在我们知道，RNA编辑广泛存在于真核生物细胞中，是RNA转录以后对基因编码进一步调控的重要生物环节，已经成为一个崭新的研究领域。

与导师Tom Maniatis合影

天道酬勤，这个ADAR1编辑酶正是杨静华苦苦寻找的关于RNA生命起源之谜的正确答案。现在我们知道，正是由于双链RNA编辑酶的存在，哺乳动物细胞双链RNA中的腺嘌呤被编辑，使得双链RNA结构被拆开，形成了次黄嘌呤RNA。所以，双链RNA编辑酶的发现解释了为什么哺乳动物细胞中检测不到双链RNA的重大疑问。现代基因组学研究表明，现代生物包括哺乳动物等高等生物基因组中编码了大量双链RNA，是RNA起源学说中原始生命形式的“活化石”，在现代植物、昆虫、病毒等高低等生物中仍然广泛存在。所以，双链RNA编辑酶的发现也是对RNA生命起源学说的有力支持。

在耶鲁大学——揭秘双链RNA和“黑色物质”

杨静华在双链RNA编辑领域的研究成果进一步演化为RNA生命起源学说中的另一个难题：既然哺乳动物包括人类基因组编码大量双链RNA基因，在双链RNA编辑酶的作用下转为次黄嘌呤RNA，那么为什么现代哺乳动物中并没有发现大量的次黄嘌呤RNA？为此，生命科学领域同行常常把双链RNA和次黄嘌呤RNA称为哺乳动物中的“黑色物质”。

1998年，杨静华从上百个申请者中得到了耶鲁大学医学院独立研究员和Assistant Professor的职位，拥有了自己独立的实验室，先后获得了美国国立卫生院NIH RO1研究基金、NIH KO2独立职业发展基金，以及SusuanG Koman基金会乳腺癌研究基金的支持，成为耶鲁大学癌症中心的研究员。在此期间，杨静华领导的团队针对人类双链RNA进行了深入研究，发表了一系列高水平研究论文，成为“黑色物质”研究领域的学术带头人。

杨静华领导的研究团队证明哺乳动物细胞中广泛存在双链RNA编辑酶，弄清楚了双链RNA编辑酶的蛋白质功能结构、细胞核内外分布、表达转运机制以及双链RNA的加工、调控和信号转导等。值得强调的是，哺乳动物双链RNA编辑酶受到外界刺激过程中出现急剧应激反应，特别是受到病毒感染的时候表达急剧增加，说明双链RNA信号在抗病毒过程中的重要作用。

研究结果与预测的完全一致，杨静华研究团队进一步证实了哺乳动物细胞在感染条件下不但产生了大量的次黄嘌呤RNA，而且主要产生在编码蛋白质的信使RNA（mRNA）中，反而在核糖体RNA(rRNA)和核内小RNA(snoRNA)很少存在。次黄嘌呤RNA聚集在细胞核中转录活跃的核小体区域。这个结果又一次证实双链RNA确实表达了，但是被定量地转换成次黄嘌呤RNA了。

杨静华进一步解释说，从RNA生命起源学说的角度上来讲，低等生物和高等生物在进化过程中对原始双链RNA的遗传功能做了不同的选择。很多低等生物，特别是病毒仍然以双链RNA作为遗传物质或成为DNA复制的中间体。相反，在哺乳动物细胞中，人类双链RNA的遗传功能已经完全被DNA取代，而且双链RNA的表达被双链RNA编辑酶严格控制，正常情况下检测不到双链RNA的表达。现在我们找到，正是利用这个差别，哺乳动物细胞通过识别双链RNA来感知是否被低等生物侵犯。

杨静华感慨地说，经过进化选择，作为最早生命形式的双链RNA变成了哺乳动物细胞遭受低等生物侵犯的危险信号，说明生命形式的多样性和可塑性。生命可以由一种形式转化为另外一种形式。

在波士顿大学——迎接双链RNA带来的挑战

2006年，杨静华获得波士顿大学副教授的位置，出任VA医学中心肿瘤外科研究室和临床蛋白质组实验室主任。同时，在探索生命编码秘密的道路上，他也面临更严峻的挑战。

杨静华在双链RNA方面的研究成果给生命科学带来了进一步的挑战。首先，为什么在人类基因组和转录组研究中并没有发现次黄嘌呤—RNA对应cDNA信息？其次，为什么人类蛋白组中并没有由次黄嘌呤RNA带来的非基因编码氨基酸序列？

每当理论与现实产生分歧的时候，往往意味着存在新突破的机会。

2016年杨静华在波士顿大学的研究团队参加会议时与Azadzoi教授（左4）合影

杨静华说，既然人类转录组中没有发现大量的次黄嘌呤信使RNA，说明人们在认识基因组（DNA）到转录组（cDNA)的过程中存在漏洞。在现代生物技术中，DNA序列可以直接分析，但是RNA的序列必须经过反转录成cDNA再经过测序的。也就是说，人们并没有直接测定过真正转录出来的RNA，当然也没有测定过次黄嘌呤RNA的序列。

在波士顿大学期间，杨静华领导的团队发现，反转录酶在通常情况下并不能有效地识别RNA中的次黄嘌呤。经过测量，正常情况下反转录酶通过次黄嘌呤的效率下降3个数量级。所以当RNA序列中含有多个次黄嘌呤的时候，反转录全长RNA的几率几乎忽略不计。所以，这就解释了为什么现代测序技术不能正确地反映次黄嘌呤RNA的存在。为了彻底回答揭示哺乳动物中的“黑色物质”，杨静华解释道，必须找到或人为制造一种可以识别次黄嘌呤的反转录酶突变体，这样就能直接研究人类体内这些看不见的遗传物质了。

对人类进化来讲，双链RNA已经进化成为人类必须时时刻刻应对的危险信号。杨静华解释说，低等生物特别是病毒仍然依赖原始的双链RNA作为它们赖以生存的生命特征，人类早已经把双链RNA作为病毒侵犯的直接证据，通常当作治病相关分子特征（pathogen associated molecular pattern, PAMP）。

根据这个特征，杨静华提出了一种广谱抗病毒理念并设计了一种抵抗病毒感染的“双链RNA依赖型自杀多肽”(dsRNA-dependent caspase recruiter, dsCARE)。这个dsCARE对各式各样的病毒感染，包括类萨斯病毒、禽流感病毒，口蹄疫病毒，甚至是死亡率极高的埃博拉病毒都有百分之百的抵抗作用，特别适用于预防那些突发性、高变异性和新型未知病毒感染（FASEB 25:1767, 2011；JVI 87:5384,2013;SciRep 6:22550, 2015）。毫无疑问，针对dsCARE进一步研究，有利于广谱抗病毒疫苗的开发，其最终产物特别适用于类似萨斯那样完全未知或尚未鉴定的病毒爆发情况下，对医务人员和高危险人群提供有效防护。

熵的“意识”——双链RNA的热力学研究

双链RNA的研究为杨静华打开了探索生命秘密的大门，更进一步演化到对人类意识形态的思考。从双链RNA作为最早的生命形式，到双链RNA作为人类细胞的危险信号，再到双链RNA为基础的广谱抗病毒理论，真正让杨静华困惑的却是现代人意识的形成和分子进化基础。既然意识也是生命的一部分，但又不像双链RNA那样具有可观察的物理特性。那么，现代人类意识的生物化学基础是什么？人类细胞对双链RNA原始生命体的弃舍是不是就是在分子水平的生物意识？

于是，杨静华提出了一个针对RNA生命起源学说具有挑战性的假设，即双链RNA作为原始生命形式应该具备生物意识的基本元素。假设在地球早期环境的RNA时期，一团RNA可以完成自我复制形成多个RNA子代，其过程一定遵循热力学定律。那么，这团具有生命特征的双链RNA和生成它之前的化学成分相比，就是一个特殊的能量状态E=ΔH+ΔS。双链RNA的化学能量状态ΔH应该对应于生命体的复制，双链RNA的熵能ΔS应该对应于生命体形成的意识状态。

通过对RNA生命起源的深入研究，杨静华认为，双链RNA复制过程的熵变是原始生物生存意识的基本单元。按热力学第二定律，自发过程一定是熵增过程，说明双链RNA这个生命体就具有一种复制生命的天然倾向或“生存意识”，而生存意识正是现代复杂生命体意识形态背后的基本元素。按照这个假设推断，复杂生命的意识应该是整个生物体熵的集合，是各个器官、组织和细胞中的每个生物化学过程熵的集中反映和意识叠加。

和学生们合影

对于意识和熵的关系还需要进行进一步的验证。如何设计和测定双链RNA复制过程的熵变，进一步解析熵的意识属性和叠加规则是证实复杂意识的关键，也是解释人类意识的本质和制造具有自我意识人工智能的理论基础。

回国——率先提出非编码氨基酸概念

应该指出，RNA生命起源学说揭示了生命遗传物质的非唯一性。特别是双链RNA编辑的发现给生命科学带来了一个更加严肃的问题，基因编码蛋白质的可靠性。既然基因翻译过程中经过了RNA编辑，那么真正人类体内的蛋白质与基因编码的蛋白质序列应该存在很大差异。加上人类体内具有各种非标准氨基酸和蛋白质翻译后修饰，可以想象，真正天然蛋白质和基因编码蛋白质应该存在很大差别。但是，杨静华解释说，由于蛋白质测序技术的限制，人们还不能大规模地测定蛋白组的序列。事实上，基因库所收集的蛋白质序列基本上是对DNA序列的理论翻译。更广泛地说，人们并不知道基因编码的蛋白质序列在多大程度上反映了真实的人类蛋白质？

为了研究真实的蛋白质，杨静华首先提出了“非编码氨基酸”的概念，即把天然蛋白质中任何与基因理论编码不一样的氨基酸残基定义为非编码氨基酸（non-coded amino acids, ncAAs）。杨静华决心利用蛋白质质谱技术解开非编码氨基酸之谜。

在导师Tom Maniatis60岁生日的师生聚会上

其实，从1995年开始，还在哈佛大学Tom Maniatis实验室做博士后的时候，杨静华就使用了质谱蛋白质测定技术并确立了RNA编辑酶的序列（PNAS 94:4354,1997）。在耶鲁大学期间，他继续关注质谱蛋白质测定技术并且又确定了RNA编辑酶复合物中多个蛋白质的序列。2006年到了波士顿大学以后，杨静华获得了两台蛋白质谱设备专项基金的支持，创建了临床蛋白组实验室并兼任主任。在广谱抗病毒理论研究受到严重干扰的时侯，杨静华毅然迈向了挑战非编码氨基酸这个崭新的领域。但是由于需要大量人类疾病组织样本，这个项目在波士顿大学进展得非常缓慢。

2012年，为了解决人类疾病样本资源的困难，杨静华以特聘教授并兼任山东大学癌症研究中心主任的身份，与山东大学展开了紧密合作。在杨静华的领导下，他的研究团队攻克了一个又一个技术难关，解决了准确测定非编码氨基酸的技术难题。结果表明，人类精子蛋白组中至少存在600多种非编码氨基酸，分布在将近4万个蛋白位点上，大部分从未报道过。这个结果超出了人们的想象，说明真实的蛋白质氨基酸序列和DNA编码的理论蛋白质氨基酸序列存在很大差别，也说明真实蛋白质序列的多样性。和单核苷酸多样性相比，蛋白质氨基酸多样性更直接地影响着蛋白质的功能，更可能参与生理病理过程，更有望成为药物靶向和疾病标记物。可以说，继基因水平上的单核苷酸多样性，人类蛋白组非编码氨基酸的大规模测定技术将在蛋白质水平上的精准医疗领域发挥关键作用。

目前，在非编码氨基酸大规模测定技术方面，杨静华团队已经申请了超过20多项发明专利，其中多项已经获得了国际专利。

任重道远——助力人类重大疾病的精准医疗

研究生命起源不是目的，杨静华解释说，揭示生命奥秘的最终目标是造福于人类健康。

2017年，郑州大学第一附属医院特别邀请杨静华成立了一个临床系统生物学研究中心，目标是建立一个大规模测定人类重大疾病非编码氨基酸的质谱平台和一个世界一流的人类重大疾病组织样本库。通过与临床一线医生的紧密合作，针对临床治疗中的具体问题，建立疾病相关非编码氨基酸数据库，开发相关精准医疗检测技术。

杨静华解释说，以蛋白组氨基酸多样性为基础的蛋白检测技术为精准医疗开辟了更准确的医疗途径，使精准医疗从基因组水平过度到了蛋白组水平。所以，研究和开发针对人类常见和重大疾病的蛋白检测技术，具有深远的理论意义和更大的市场价值。杨静华的长期目标就是建立和完善人类重大疾病相关非编码氨基酸数据库，在蛋白水平上揭示人类重大疾病的致病机制，开发以蛋白质多样性为基础的精准医疗技术。

可以预见，随着人类疾病相关非标准氨基酸数据的完善，蛋白组氨基酸多样性将在人类重大疾病的诊断、预后、用药、治疗等方面产生深远的影响，成为精准医疗的重要组成部分。所以，以蛋白组氨基酸多样性为核心，研究和开发人类重大疾病相关的非编码氨基酸及其蛋白检测技术，将带动国内外精准医疗市场的全面发展，有望成为精准医疗领域具有独立知识产权的引领企业。

任重道远，杨静华表示要尽力早日实现这个目标！