假 提取物对断奶仔猪回肠黏膜组织形态及通透性的影响

王定发，周璐丽，胡海超，周汉林

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737）

小肠是动物消化和吸收养分的重要场所，同时也是动物机体的免疫器官。肠黏膜屏障由肠黏膜表面的粘液层、肠上皮及其紧密连接、上皮基底膜、黏膜下固有层等组成，其中紧密连接对维持肠黏膜上皮屏障功能有重要作用[1]。仔猪断奶应激可引起食欲差、消化功能紊乱、生长迟缓、饲料利用率低等，进而导致肠黏膜细胞因子分泌改变，肠绒毛高度降低、上皮绒毛变短、隐窝变深等形态学变化，并增加肠道黏膜通透性，造成肠道消化吸收功能下降，致使腹泻率显著提高[2-3]。应用抗生素、化学药物作为饲料添加剂是长期以来提高断奶仔猪生长性能和抗腹泻的有效手段[4]，但在实际使用过程中产生的耐药性及药物残留等问题引起人们广泛关注。为此，中外研究人员开展了大量有益的尝试和研究[5-7]，寻求和开发植物提取物作为新型饲料添加剂来减少或替代饲料中抗生素的使用。

1 材料与方法

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 将80头21日龄断奶的杜×长×大三元杂交仔猪，随机分为4组，每组5个重复，每个重复4头猪。4组分别为在基础日粮中添加0（T0组）、50（T50组）、100（T100组）和200（T200组） mg/kg假提取物粉剂。参考美国NRC（2012）5～10 kg生长猪营养需要配制基础日粮，其组成及营养成分见表1。整个试验期为28 d，自由采食，自由饮水。

1.2.2 样品采集及测定 在试验的第1和29天清晨对仔猪进行空腹称重，以重复为单位记录仔猪每天的采食量，计算平均日采食量、平均日增重和耗料增重比（日采食量/日增重）。分别在试验开始第15天和第29天清晨，每个重复随机选取1头仔猪，前腔静脉采集血液，37 静置2 h， 3500 r/min离心10 min得到离心分离血清，采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定血清中D-乳酸（D-LA）、内毒素（ET-1）以及二胺氧化酶（DAO）浓度，方法参照试剂盒说明书。

于试验期第29天清晨，每个重复随机选取1头猪进行屠宰，取回肠组织，以4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，H.E.染色，光镜观察并记录组织学变化。

取回肠黏膜，液氮速冻，于-80 保存。利用RNA提取试剂盒（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海）提取回肠黏膜总RNA，反转录试剂盒（百泰克生物技术有限公司，北京）反转录得到cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参照，利用实时荧光定量PCR技术对回肠黏膜相关的紧密连接蛋白[咬合蛋白（Occludin）、闭合小环蛋白-1（ZO-1）、封闭蛋白-1（Claudin-1）]和钠氢离子交换蛋白-3（NHE-3）进行定量分析。相关引物由上海生工合成，序列见表2。1.3 统计分析 利用Excel 2010整理数据后，采用SAS 9.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），并用Tukey's法对各组平均值进行多重比较，数据用平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结 果

2.3 断奶仔猪回肠形态结构 由图1可见，与对照组相比，日粮添加50～200 mg/kg的假提取物后，仔猪回肠黏膜绒毛宽度和高度均有所改善。

2.4 仔猪回肠黏膜紧密连接蛋白和NHE-3的mRNA表达 由表5可知，日粮中添加假提取物组仔猪回肠黏膜中Occludin的mRNA表达显著上调（P＜0.05），100、200 mg/kg 组Claudin-1的mRNA表达显著高于其他2个组（P＜0.05），100 mg/kg 组 NHE-3显著高于其他3个组（P＜0.05）；而ZO-1的mRNA表达无显著变化（P＞0.05）。

表2 RT-PCR所用引物

表3 假提取物对断奶仔猪生产性能的影响

表3 假提取物对断奶仔猪生产性能的影响

注：同行数字肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）。下表同

项目 T0 T50 T100 T200初始体重 ,kg 6.39±0.01 6.43±0.03 6.43±0.05 6.47±0.06结束体重 ,kg 12.84±0.86ab 13.89±0.08a 12.85±0.34ab 12.24±0.31b平均日增重 ,g 222.56±19.74b 257.39±3.65a 221.52±10.03b 198.99±8.48b平均日采食量 ,g 373.55±1.75c 421.95±4.63a 387.64±5.63b 331.20±6.43d耗料增重比 1.70±0.04 1.64±0.04 1.75±0.10 1.67±0.10

表4 假 提取物对断奶仔猪血清DAO、D-LA和ET-1浓度影响

表4 假 提取物对断奶仔猪血清DAO、D-LA和ET-1浓度影响

项目 T0 T50 T100 T200第15天DAO, ng/mL 9.29±0.30a 8.84±0.15a 6.44±0.31b 6.34±0.22b D-LA, μg/L 1695.00±87.50a 1595.00±112.50a 1257.33±100.00b 895.00±112.50c ET-1, ng/L 417.41±3.88a 393.70±11.21b 171.29±3.28b 131.63±0.63c第29天DAO, ng/mL 7.80±0.30a 6.99±0.15b 6.71±0.23bc 6.14±0.25c D-LA, μg/L 1457.50±175.00a 1182.50±150.00a 807.50±125.00b 557.50±75.00b ET-1, ng/L 285.52±21.30a 221.48±20.78b 200.17±12.50b 216.08±21.55b

表5 断奶仔猪回肠黏膜紧密连接蛋白和NHE-3的mRNA表达

3 讨 论

图1 断奶仔猪回肠形态结构（H.E.，100×）

在日粮中添加植物源饲料添加剂可缓解仔猪断奶应激导致的仔猪生长性能下降及腹泻。本试验中，日粮添加50 mg/kg假提取物显著增加了断奶仔猪的平均日采食量和日增重，降低了耗料增重比。这可能与假提取物具有抗胆碱酯酶[12]和抗菌消炎[8-9]等活性有关。抗胆碱酯酶可使胃肠道平滑肌兴奋，促进胃肠蠕动并增加胃酸分泌，从而提高动物胃肠道对饲料中营养物质的消化和吸收能力，而且提取物的抗菌消炎活性有助于肠道微生物菌群的调节，抑制有害病菌与机体竞争营养物质。属胡椒科植物，具有辛辣气味，日粮中添加100～200 mg/kg 假立草 句 提取物可能影响到饲粮的适口性，进而降低仔猪日均采食量。

肠道是断奶应激的主要损伤部位之一，断奶应激会改变仔猪肠道形态，损伤肠黏膜，从而使胃肠道对营养物质的消化和吸收能力减弱。在本试验中，日粮中添加提取物可以改善和修复断奶仔猪回肠黏膜损伤。假提取物含有总酚、黄酮类、不饱和烯类等活性成分[13]，具有较强的抗氧化和抗炎活性[8-9]，有助于改善和修复断奶仔猪肠道损伤。

断奶应激会损伤仔猪肠道黏膜屏障，增大肠道黏膜通透性，破坏肠道对水分及养分的正常吸收功能，从而导致腹泻[14]。血清中D-LA、ET-1和DAO浓度变化可以作为反映肠道通透性的指标[15]。DAO是存在于肠黏膜绒毛中的细胞内酶，D-LA和ET-1是肠道内细菌发酵代谢产物，在正常情况下，三者都主要存在于肠道内。当肠黏膜受损导致通透性增加时，肠道内的D-LA、ET-1和DAO会通过受损黏膜渗透进入血液。本试验中，前期仔猪血清中D-LA、ET-1和DAO浓度高于后期，说明断奶应激对肠道通透性具有极大的影响，损伤了肠道黏膜结构，破坏了肠道菌群和绒毛组织，使得肠内D-LA、ET-1和DAO渗透入血。日粮中添加提取物使仔猪血清中D-LA、ET-1和DAO浓度显著下降，说明提取物中活性成分有助于修复仔猪肠道损伤，改善肠道通透性。紧密连接蛋白是肠道通透性的结构基础，Occludin、ZO-1和Claudin-1常被作为肠道组织紧密连接屏障和通透性功能的指标[16]。仔猪断奶前后紧密连接蛋白mRNA高表达对仔猪抗腹泻具有重要意义[17]。NHE-3广泛存在于哺乳动物肠道黏膜上皮细胞，对营养物质的吸收，特别是电解质平衡起着重要的调控作用。在肠道黏膜损伤发生炎症时，小肠液体过度分泌、离子通道的通透性增加，NHE-3表达水平下降，易导致肠上皮细胞内水、电解质失衡而产生水样腹泻。在应激情况下，细菌和内毒素通过调节或影响一些细胞因子及蛋白激酶等来调控ZO-1和Occludin的表达，从而降低肠道上皮细胞的屏障功能。而且有研究表明，上皮细胞紧密连接蛋白的基因表达与肠道细菌的代谢产物有关[18]。本试验结果表明，添加提取物可显著上调仔猪肠黏膜中Occludin、Claudin-1和NHE-3的mRNA表达。前期研究表明，日粮中添加提取物，可显著降低仔猪肠道黏膜中 TNF-α、ⅠL-1β和 ⅠL-6 mRNA 表达[10]。提取物的抗菌活性可能影响了肠道内细菌的代谢，日粮中添加假立草 句提取物可能是通过影响肠道内细菌代谢及肠道黏膜中细胞因子来上调Occludin、Claudin-1和NHE-3的mRNA表达，改善肠道形态，进而降低肠道通透性。

4 结 论