独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞PERK／Bip通路关键调控蛋白的影响

陈 俊 ，许惠凤 ，郑春松 ，叶锦霞 ，陈振沅 ，邱建清 ，刘淑如 ，刘献祥 ，吴广文

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种多见于中老年人的退行性关节疾病，发病率随年龄而增加［1］，易反复发作、缠绵难愈，具有较高的致残率［2－3］，其防治已成为医学界研究的难点问题之一。独活寄生汤长期应用于治疗KOA，疗效显著［4-7］。前期研究表明独活寄生汤通过抑制软骨基质主要成分丢失，有效减轻KOA大鼠关节软骨基质破坏［8］；通过激活G蛋白偶联信号传导通路抑制软骨基质降解，修复受损的软骨组织［9］；有效抑制软骨细胞凋亡［10］，但是否通过调节蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）／免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulin-binding protein，BiP）信号通路，尚不明确。本实验进一步观察独活寄生汤含药血清对大鼠退变软骨细胞PERK／Bip信号通路关键调控因子PERK、Bip、真核细胞翻译起始因子-2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α）、转录激活因子-4（activating transcription factor 4，ATF-4）、生长抑制 DNA损伤基因153抗原（growth arrest and DNA damage-inducible 153，GADD153）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase）-9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase）-3 蛋白的影响，探讨独活寄生汤抑制软骨细胞凋亡的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 36只2月龄和20只4周龄清洁级雄性SD大鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK（沪）2012-0002］。

1.2 实验药物 独活寄生汤的组成药物均购于福建中医药大学附属第二人民医院药剂科。

1.3 实验试剂 DMEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司）；0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；Ⅱ型胶原酶粉末（美国Sigma公司）；Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153 和 Caspase-3一抗（美国 abcam公司）；Caspase-9一抗（美国Thermo Fisher Scientific公司）；PERK 一抗、二抗（美国Cell Signaling Technology公司）。

1.4 实验仪器 蛋白核酸分析仪（美国Beckman Coulter公司）；化学发光成像系统ChemiDocXRS+（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 含药血清和空白血清的制备 36只2月龄SD大鼠，随机分为含药血清组和空白血清组2组，18只／组。根据临床等效剂量换算［11］，含药血清组按照 9.3 g／（kg·d）的剂量灌服独活寄生汤，空白血清组按照10 mL／（kg·d）的剂量灌服0.9%生理盐水，连续灌胃7 d后，麻醉后行腹主动脉采血，离心获取上层血清，56℃水浴灭活30 min，-20℃保存备用。

2.2 细胞模型的复制和药物干预 参照课题组前期取材方法，将4周龄大鼠用75%酒精浸泡5 min，无菌条件下游离并截取膝关节，置入无菌培养皿，带入超净工作台操作。先用PBS充分漂洗，刮除关节周围附着的肌肉、脂肪等组织后用PBS充分漂洗。用刀片削取每个关节表面的软骨，PBS充分漂洗软骨小块3次，采用酶消化法，消化、获取正常软骨细胞［12］，培养、传代至第三代，再予 10 ng／mL IL-1β诱导24 h，获得退变软骨细胞［13-14］。含药血清和空白血清分别干预24、48和72 h后，检测相关指标。

2.3 Western Blot法检测退变软骨细胞蛋白表达血清干预结束后，提取退变软骨细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，Western Blot法检测PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9 和 Caspase-3蛋白表达情况，抗体稀释倍数如下：PERK（1∶1 000）、Bip（1∶5 000）、eIF-2α（1∶2 500）、ATF-4（1∶1 000）、GADD153（1∶2 500）、Caspase-9（1∶300）和 Caspase-3（1∶500）。

2.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的采用（±s）进行描述。2组间比较采用重复测量方差分析；同一时间点2组间比较使用Multivariate分析。

3 结果

3.1 血清干预退变软骨细胞蛋白电泳结果 见图1。

图1 血清干预退变软骨细胞蛋白电泳图

3.2 血清对退变软骨细胞蛋白表达的影响 见表1～7。

表1 2组退变软骨细胞中PERK蛋白含量比较（s）

表1 2组退变软骨细胞中PERK蛋白含量比较（s）

注：1）主效应的F值和P值；2）交互效应的F值和P值。

组别空白血清组含药血清组F值P值干预24 h 0.312±0.006 0.228±0.038 14.008 0.020干预48 h 0.227±0.037 0.160±0.018 7.808 0.049干预72 h 0.189±0.037 0.113±0.021 9.293 0.038 F值30.820 55.768 77.0041）0.3812）P值0.013 0.004 0.0001）0.6382）

表2 2组退变软骨细胞中Bip蛋白含量比较（±s）

表2 2组退变软骨细胞中Bip蛋白含量比较（±s）

注：1）主效应的F值和P值；2）交互效应的F值和P值。

组别空白血清组含药血清组F值P值干预24 h 0.696±0.059 0.503±0.051 18.368 0.013干预48 h 0.536±0.043 0.364±0.055 18.015 0.013干预72 h 0.476±0.041 0.224±0.106 14.590 0.019 F值77.185 47.739 109.6441）3.0042）P值0.012 0.008 0.0001）0.1382）

表3 2组退变软骨细胞中eIF-2α蛋白含量比较（±s）

表3 2组退变软骨细胞中eIF-2α蛋白含量比较（±s）

注：1）主效应的F值和P值；2）交互效应的F值和P值。

组别空白血清组含药血清组F值P值干预24 h 0.391±0.042 0.250±0.042 16.876 0.015干预48 h 0.309±0.032 0.127±0.010 89.436 0.001干预72 h 0.227±0.064 0.071±0.022 16.069 0.016 F值14.513 26.219 38.0631）0.5602）P值0.039 0.020 0.0001）0.5802）

表4 2组退变软骨细胞中ATF-4蛋白含量比较（±s）

表4 2组退变软骨细胞中ATF-4蛋白含量比较（±s）

注：1）主效应的F值和P值；2）交互效应的F值和P值。

组别空白血清组含药血清组F值P值干预24 h 0.851±0.075 0.632±0.099 9.420 0.037干预48 h 0.696±0.085 0.494±0.064 10.724 0.031干预72 h 0.544±0.087 0.389±0.035 8.251 0.045 F值31.726 19.662 50.5691）0.7322）P值0.022 0.033 0.0011）0.4672）

表5 2组退变软骨细胞中GADD153蛋白含量比较（s）

表5 2组退变软骨细胞中GADD153蛋白含量比较（s）

注：1）主效应的F值和P值；2）交互效应的F值和P值。

组别空白血清组含药血清组F值P值干预24 h 0.638±0.059 0.446±0.080 11.192 0.029干预48 h 0.501±0.038 0.294±0.080 16.298 0.016干预72 h 0.436±0.080 0.226±0.044 15.773 0.017 F值15.375 31.152 42.3151）0.0792）P值0.035 0.008 0.0001）0.9052）

表6 2组退变软骨细胞中Caspase-9蛋白含量比较（±s）

表6 2组退变软骨细胞中Caspase-9蛋白含量比较（±s）

注：1）主效应的F值和P值；2）交互效应的F值和P值。

组别空白血清组含药血清组F值P值干预24 h 0.458±0.016 0.354±0.059 8.848 0.041干预48 h 0.357±0.051 0.189±0.081 9.141 0.039干预72 h 0.212±0.030 0.110±0.056 7.832 0.049 F值123.452 150.302 265.0941）6.1632）P值0.005 0.002 0.0001）0.0402）

表7 2组退变软骨细胞中Caspase-3蛋白含量比较（±s）

表7 2组退变软骨细胞中Caspase-3蛋白含量比较（±s）

注：1）主效应的F值和P值；2）交互效应的F值和P值。

组别空白血清组含药血清组F值P值干预24 h 0.580±0.066 0.420±0.025 15.326 0.017干预48 h 0.474±0.063 0.342±0.038 9.667 0.036干预72 h 0.395±0.046 0.208±0.058 19.352 0.012 F值53.426 22.944 59.5061）1.1772）P值0.013 0.038 0.0011）0.3432）

4 讨论

KOA是在多种因素共同作用下，软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果［15］，是常见的骨关节疾病之一［16］。 细胞凋亡是关节软骨细胞的中心性特征，是关节软骨退行性改变的病理因素之一［17-18］。研究表明内质网应激反应与软骨细胞凋亡密切相关［19］，PERK／Bip 信号通路则是调控内质网应激反应引起软骨细胞凋亡的关键通路［20-21］。PERK信号分子的激活可以磷酸化eIF-2α，后者可激活ATF-4，上调 GADDl53表达，GADDl53则抑制Bcl-2的表达，导致Bcl-2／bax比例失衡，引起Caspase-9激活，活化的Caspase-9再激活 Caspase-3，从而启动细胞的凋亡程序［22-24］。

KOA属中医“痹证”“痿证”范畴，气血营卫亏虚是致病内因，风寒湿邪外袭是致病外因。独活寄生汤中独活祛下焦与筋骨间的风寒湿邪，为君药。细辛散阴经风寒，搜筋骨风湿，通络止痛；秦艽除风湿舒筋；肉桂心温里祛寒，通利血脉，均为臣药。桑寄生、牛膝、杜仲补肝肾，壮筋骨，祛风湿；当归、川芎、地黄、芍药养血活血；人参、茯苓、甘草补气健脾，扶助正气，均为佐药。甘草调和诸药，为使药。诸药合用，祛邪扶正，标本兼顾，最终达到祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功，能针对KOA病机，起治疗作用［25-26］。

为了进一步阐明独活寄生汤含药血清抑制退变软骨细胞凋亡的机制，本研究采用Western Blot法检测PERK／Bip信号通路中关键调节因子PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达，结果发现随着干预时间的延长，空白血清 组 和 含 药 血 清 组 PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3 蛋白表达量均逐渐降低，以含药血清组降低更为明显，表明空白血清组和含药血清组均可时间依赖性地降低PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3表达，且含药血清组效果优于空白血清组。

综上可知，独活寄生汤可能是通过调控PERK／Bip信号通路中关键调节因子PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9 和 Caspase-3 蛋白表达，进而抑制软骨细胞凋亡，从而起到治疗KOA的作用。