生肌三法分类创面免疫荧光四重染色病理学特点分析

王广宇，王 雨，王雷永，徐旭英

（首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010）

北京中医医院疮疡血管外科（简称我科）对糖尿病伴足部慢性溃疡（diabetic foot chronic ulears，DFCUs）的长期治疗过程中，基于传承，总结认为：创面局部存在虚、瘀、毒三个病理过程，并且相互转化、影响，某一阶段为主要矛盾，提出祛腐、化瘀、补虚为主要治则，以朱红膏、紫色疽疮膏、回阳生肌膏为核心药物的“生肌三法”理论。α－平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，αSMA）、CD68、CD34 分别是成纤维细胞内、巨噬细胞表面、内皮细胞表面特异性标志物，增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，细胞DNA合成期表达，反映细胞的增殖状态和局部创面增生、去除坏死组织、循环状态的能力。本文依据生肌三法辨证选取创面组织，利用免疫荧光四重染色技术，对其皮肤真皮浅层的病理学特点做初步探讨。

1 临床资料

1.1 西医诊断标准 参照2015年国际糖尿病足工作组发布《国际糖尿病足慢性创面管理指南》［1］中DFCUs的诊断标准：糖尿病伴足部溃疡4周以上未能愈合，也无明显愈合趋势的创面。

1.2 中医辨证标准 参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》［2］局部辨证方法：① 湿热证：创面渗出较多，腐肉不脱，创周红肿，界限不清；② 血瘀证：创面溃烂经久，渗出物较少或干枯无脓，腐肉少许或腐肉虽脱，但新肉难生，创周肤色暗无红肿；③阳虚证：创面灰白色或紫暗，腐肉较多伴有渗出物清稀，或如粉浆，创周无红肿。

1.3 纳入标准 ① 符合上述诊断及辨证标准者；② 年龄65～85岁；③ 疮面面积4～30 cm2，深至皮下组织，但未及骨质；④ 同意加入本研究，并签属知情同意书。

1.4 排除标准 ① 合并有放射、结核、癌性等创面；② 合并有恶性肿瘤、急性心脑血管意外、肾功能不全、严重肝脏损伤等全身性疾病。

1.5 一般资料 选取2016年1月—2017年5月于我科住院的DFCUs患者30例，符合入选条件患者依据局部辨证方法分为湿热证组、血瘀证组、阳虚证组各10例，3组年龄、病程、溃疡面积等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。另外取5例大腿截肢患者截除肢体近端皮肤组织标本作为正常组。本临床研究经首都医科大学附属北京中医医院伦理委员会批准。

2 方 法

2.1 主要试剂和仪器 M ASSON复合染色液、DAB显色液（北京中杉金桥公司）；TSA plus荧光试剂盒（美国PerkinElmer公司），其中包括TNT洗涤缓冲液（货号：PF1011）、TNB 封闭缓冲液（货号：PF1012）；ZEN显微图像分析软件（德国Carl Zeiss Microscopy GmbH公司）

2.2 标本采集及处理 本研究所需标本均为清创或截肢后废弃的组织，所取标本需包括创面边缘皮肤及皮肤真皮浅层，截除肢体选择近端皮肤组织。组织获取后立即放入10%中性福尔马林溶液中保存，按常规方法进行脱水、固定、石蜡包埋。

2.3 MASSON三染 石蜡标本切片 4～5μm，脱蜡至水，置于玻片上，严格按说明书步骤进行染色。

2.4 免疫荧光四重染色 ① 标本准备：将石蜡标本切片4～5μm，脱蜡至水，置于玻片上。② 消除内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育15 min消除内源性过氧化物酶，倾倒后组织切片上滴注TNB封闭缓冲液，湿室中37℃孵育45 min。③ 滴加一抗：倾走TNB封闭缓冲液，滴加一抗抗体（小鼠抗人 CD68 抗体 1∶100，小鼠抗人 CD34 抗体 1∶50，小鼠抗人 PCNA抗体 1∶100，小鼠抗人 αSMA抗体 1∶50），每张组织切片滴加200μL，要求完全覆盖组织，湿室中4℃过夜。④ 滴加二抗：TNT洗涤缓冲液冲洗玻片5 min×3次，滴加相对应的二抗抗体（FITC标记的山羊抗小鼠 IgG抗体 1∶2 000，Cyanine3标记的山羊抗小鼠IgG抗体1∶4 000，Coumarin标记的山羊抗小鼠IgG抗体1∶2 000，Cyanine5标记的山羊抗小鼠IgG抗体1∶3 000），每张组织切片滴加200μL，完全覆盖组织，室温孵育45 min后4℃过夜。⑤ 封闭：TNT洗涤缓冲液冲洗玻片5 min×3次，TNB封闭缓冲液每张切片滴加200μL，要求完全覆盖组织，室温孵育8 min。⑥ 镜下观察：玻片TNT洗涤缓冲液冲洗5 min×3次，无水乙醇脱水，中性树酯固定，置于荧光显微镜下观察，四种荧光素的最大吸收光波长（前）和最大发射光波长（后）分别为：Cyanine5（648 nm，667 nm），Cyanine3（550 nm，570 nm），FITC（402 nm，443 nm），Coumarin（402 nm，443 nm）。ZEN显微图像分析软件合成图像并计数。［3－6］

表1 3组一般资料比较（±s）

表1 3组一般资料比较（±s）

组别湿热证组血瘀证组阳虚证组n 10 10 10年龄／岁75.3±10.1 78.1±11.3 75.1±9.5糖尿病病程／a 18.3±5.3 20.1±6.9 19.5±10.8创面病程／周14.4±5.8 17.3±6.6 16.4±7.4 HbA1c／%7.4±5.1 8.2±4.2 7.9±5.2踝肱指数0.8±0.2 0.8±0.3 0.8±0.4溃疡面积／cm2 14.3±4.4 15.3±6.3 13.6±4.1胫前经皮氧分压／mmHg 30.4±7.2 25.6±4.7 28.5±6.1

2.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 4组皮肤组织MASSON染色情况 ① 正常组皮肤浅层结构清晰，微血管内径大小不等，胶原纤维形态饱满，排列欠整齐，微血管外炎症细胞极少见。②湿热证组皮肤浅层微血管、胶原纤维等组织结构尚清晰，微血管内径大小不等，部分有破坏红细胞，微血管周围满布炎症细胞。③ 血瘀证组胶原纤维结构紊乱，正常组织结构大部破坏，微血管内径较大，处于扩张状态，炎症细胞分布。④ 阳虚证组皮肤浅层组织结构大部破坏，胶原纤维结构紊乱严重，微血管及炎症细胞较少。见图1。

图1 4组皮肤组织MASSON染色图（×100）

3.2 4组免疫荧光四重染色情况 ① 正常组αSMA＋细胞位于微血管内膜（湿热证组、血瘀证组、阳虚证组αSMA＋细胞位于微血管外膜），细胞粗大饱满；αSMA＋／PCNA＋细胞较多；CD68＋细胞少见；PCNA＋细胞散见于组织内，染色色彩鲜明。②湿热证组αSMA＋细胞于CD34＋细胞外，粗大、增生明显；CD68＋细胞满布，形态饱满；PCNA＋细胞数量 增加，αSMA＋／PCNA＋、CD68＋／PCNA＋、CD34＋／PCNA＋双阳性细胞数量明显增多，尤以αSMA＋／PCNA＋为甚。③ 血瘀证组CD34＋细胞数量可，形态瘦小而细，微血管内径广泛增加，CD34＋／PCNA＋细胞增多。④ 阳虚证组所有阳性细胞均较少，CD68＋细胞罕见；PCNA＋、αSMA＋细胞少见，形态瘦小萎缩。见图2。

图2 4组创面免疫荧光四重染色图（×200）

3.3 4组阳性细胞及双阳性细胞数比较见表2。

表2 4组阳性细胞及双阳性细胞数比较（±s） 个／200 视野

表2 4组阳性细胞及双阳性细胞数比较（±s） 个／200 视野

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与湿热证组比较，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

组别正常组湿热证组血瘀证组阳虚证组n 5 10 10 10 CD68＋细胞12.0±6.26 183.4±32.81）99.3±46.31）2）36.9±29.41）2）CD68＋／PCNA＋细胞2.3±1.5 24.4±7.21）4.1±2.11）2）2.4±1.2 αSMA＋细胞14.3±5.7 67.8±34.21）87.1±23.41）3）21.4±7.21）2）αSMA＋／PCNA＋细胞4.1±1.2 46.1±13.81）25.2±17.41）5.1±1.7 CD34＋细胞88.3±23.1 72.8±31.71）114.5±32.81）2）23.1±5.11）CD34＋／PCNA＋细胞3.2±1.2 33.2±12.51）64.2±22.51）2）01）2）PCNA＋细胞29.7±16.4 214.6±98.61）235.1±104.71）3）64.7±29.31）2）

4 讨论

糖尿病未溃皮肤与非糖尿病比较已存在“隐性损害”，如真皮层厚度明显变薄，炎性细胞浸润，巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等细胞功能和数量下降［7］。糖尿病伴慢性创面真皮组织中，巨噬细胞在功能和数量出现异常［8］，影响对坏死组织及细菌的清除，导致炎症反应不足，影响创面修复。成纤维细胞生长抑制和凋亡百分率显著高于非糖尿病［9-10］，导致细胞和基质附着的纤维骨架生成减少，肉芽增生也明显受到影响。糖尿病多伴有下肢微循环障碍，包括微血管数量减少，另外在研究中发现，微血管中内皮细胞舒张功能也有异常［11］。

创面的修复是按炎症、增殖、修复过程进行的，在不同时期起主要作用的细胞类型各不相同，它们之间相互依存、促进、制约，如果出现异常，导致创面停滞于修复的某一阶段，继而引起创面慢性过程。

PCNA只存在于增殖细胞核内，标志着细胞启动DNA合成和细胞增殖，从而源源不断增加创面修复所需要的蛋白及有关细胞，如果细胞PCNA阳性，就可以认为这些细胞可以在数量上逐渐增加，反映“正气”的强弱。

我科以“生肌三法”分类DFCUs，应用免疫荧光四重染色技术，初步分析其病理特点有一定的规律可循：湿热证创面巨噬细胞及其增殖型最多，主要表现为较强的慢性炎症。血瘀证组中炎症细胞明显少于湿热证创面，虽内皮细胞在数量上未见明显增多，但微血管内径扩大，是以微血管扩张所致瘀滞状态为主要特点。阳虚证相关细胞及其增殖细胞数量上均较其他组少。“生肌三法”理论将创面的复杂性简单化，DFCUs存在慢性炎症、循环瘀滞状态、功能下降为突出矛盾的三个不同病理状态，符合临床的特点。

朱红膏方组成朱砂、红粉，具有祛腐解毒等功效；紫色疽疮膏方组成以龙血竭为主药，配以紫草、赤芍、红花、血竭等，具有活血化瘀的功效；回阳生肌膏方由肉桂、炮干姜、人参、当归、黄芪、川芎等组成，具有回阳生肌的作用，研究表明，主要是促进巨噬细胞的功能，启动炎症反应的作用［12］。

本研究结果表达慢性创面中的三个病理特征，虽然并不能完全概括创面的复杂性，但也充分说明生肌三法理论将糖尿病慢性创面依据局部辨证提出三个证型，代表创面三种不同病理状态，临床上相互转化、影响，各有侧重，根据局部辨证选择不同外用中药，发挥中医外用药对DFCUs治疗作用是相对专一和相对综合［13-14］，也是中医治疗疾病的特点之一。