屈头鸡果预灌胃对哮喘小鼠气道Th1/Th2型细胞因子水平的调节作用

赵展庆,张万科,符妹垂，周小敏,余秉昌，林奇栋

(1海南西部中心医院，海南儋州 571799；2海南医学院)

哮喘发病率在全球范围内呈逐年上升趋势，已成为一个严重的世界性社会公共卫生问题[1]。基于对气道炎症是哮喘的本质这一认识，传统抗炎药物糖皮质激素被认为是目前最有效的哮喘治疗药物。然而，糖皮质激素治疗过程中的诸多毒副作用不同程度地影响其在临床中的应用。屈头鸡是生长在海南少数民族山区的一种植物。现有的资料认为，屈头鸡果具有治疗咳嗽、哮喘的功效[2]，但尚无相关的观察和研究证实。目前国内外学者普遍认为，Th1细胞释放的细胞因子如IL-2、IL-10、IFN-γ，可减轻哮喘的气道炎症，抑制哮喘发作；而Th2细胞释放的细胞因子如IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等，则可加重哮喘的气道炎症，引发哮喘。2017年1～12月，本课题以屈头鸡果果浆灌胃干预哮喘小鼠，观察在治疗剂量和中毒剂量下，哮喘气道炎症相关细胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ以及IL-4、IL-5的变化，以明确其是否有抑制气道炎症的作用，并探讨其可能的机制，为今后屈头鸡果在哮喘中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要仪器与试剂 雌性SPF级BALB/c纯系小白鼠50只，鼠龄6～8周，体质量16～20 g，由海南医学院实验动物中心提供。所有小鼠饲养于海南医学院实验动物中心，SPF级实验室。屈头鸡果(海南本地产植物)；卵蛋白(美国SigmaⅤ级，纯度>98%)；氢氧化铝凝胶(广州化学试剂厂)；地塞米松注射液(广州白云山天心制药股份有限公司)；IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ ELISA试剂盒(上海川翔科技有限公司)；台式高速离心机(上海安奇科学仪器厂)；酶标仪(美国Genecore公司)。

1.2 小鼠哮喘模型制备及屈头鸡果用法 将50只小鼠随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、屈头鸡果治疗剂量组(C组)、屈头鸡果中毒剂量组(D组)、地塞米松治疗组(E组)5组，每组10只。A组第0、14天腹腔注射0.2 mL生理盐水，第24天以生理盐水10 mL雾化，每天30 min，连续28天。B组第0、14天腹腔注射0.2 mL致敏液(含卵白蛋白100 μg、氢氧化铝凝胶400 μg)，第24天以1%卵蛋白溶液10 mL雾化激发哮喘，每天30 min，连续28天。C组以上述同样方法用卵蛋白进行致敏和激发小鼠，在每次雾化激发哮喘前30 min灌胃屈头鸡果果浆2.16 g/kg[2]。D组以上述同样方法用卵蛋白进行致敏和激发小鼠，在每次雾化激发哮喘前30 min灌胃屈头鸡果果浆10.8 g/kg[3]。E组以上述同样方法用卵蛋白进行致敏和激发小鼠，在每次雾化激发哮喘前30 min腹腔注射地塞米松2 mg/kg。

1.3 小鼠肺泡灌洗液Th1、Th2型细胞因子水平检测 在末次激发结束后30 min，所有小鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，放血处死。开胸，剪开颈部皮肤暴露气管，用头皮针在颈部行气管插管并以丝线结扎固定；结扎右肺，经气管套管向左肺缓慢注入生理盐水0.5 mL，边按摩胸部边回收液体，反复抽吸3次，回收率80%以上。将取得的肺泡灌洗液取20 μL用以细胞计数，剩余放入离心管中，10 000 r/min，离心后留取上清液分装于Eppendoff管，进行IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ水平的ELISA检测。

2 结果

末次激发结束时A组、B组、C组及E组小鼠均存活，D组小鼠在给药的过程中先后死亡4只，存活的6只也存在不同程度呕吐、腹泻、心律加快和抽搐等症状。各组小鼠肺泡灌洗液Th1、Th2型细胞因子水平比较见表1、2。

表1 各组小鼠肺泡灌洗液Th1型细胞因子

注：与A组比较，★P<0.01；与B组比较，△P<0.05；与E组比较，#P<0.05，*P<0.01。

表2 各组小鼠肺泡灌洗液Th2型细胞因子水平

注：与A组比较，★P<0.01；与B组比较，△P<0.05，与E组比较，#P<0.05。

3 讨论

当致敏原经呼吸道或其他途径进入机体，机体在接触致敏原后，激活T淋巴细胞并使其分别分化为Th1细胞和Th2细胞，Th1细胞和Th2细胞可释放多种IL，参与哮喘的调节。Th1/Th2细胞的比例和功能失衡，在哮喘发病过程中扮演着重要的角色[4]。

目前认为，Th1细胞及其释放的细胞因子可减轻哮喘的气道炎症，抑制哮喘发作。Th1细胞释放的细胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ，能抑制IgE合成，并抑制IgE介导的Ⅰ型超敏反应，在哮喘的发生、发展过程中起负向调节的作用，在哮喘的发病机制中，起到对抗、抵消Th2细胞，以达到平衡的作用[5]。

Th2细胞及其释放的细胞因子则可加重哮喘的气道炎症，促发哮喘。Th2细胞主要释放IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等细胞因子。IL-4可促进B细胞增殖、分化，形成浆细胞，产生IgE。IgE与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面的高亲和性的IgE受体结合。当过敏原再次进入体内，即可与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面结合的IgE结合，并促使该细胞合成及释放多种炎症介质，使气道平滑肌收缩，黏液分泌增多，气道黏膜水肿，血管通透性增强，导致哮喘发作[6]。IL-5则可调节嗜酸性粒细胞炎症反应，促进嗜酸性粒细胞的增殖、分化，并且，还可通过上调黏附分子VCAM-1，使中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞等炎性细胞向血管内皮迁移并黏附于血管内皮。IL-5不但能促进嗜酸性粒细胞的增殖和分化，而且还能进一步促使其激活[7]。除此以外，Shi等[8]的研究结果表明，IL-5还能起到趋化作用，募集嗜酸粒细胞浸润到哮喘患者呼吸道，并且激活浸润在呼吸道中的嗜酸粒细胞。因此，Th2型细胞因子如IL-4和IL-5常作为人们研究哮喘气道炎症的重要标志物。

目前糖皮质激素被认为是防治哮喘最有效的药物。糖皮质激素能抑制气道炎症反应，有效地控制许多哮喘患者的症状。但是对于部分难治性哮喘、激素依赖性哮喘以及重症哮喘，糖皮质激素疗效欠佳[9]。另外，糖皮质激素的毒副作用也不同程度地影响其在临床中的应用[10]。因此，人们尝试寻找一些有效且不良反应少的抗炎药物。屈头鸡是一种生长在海南、广东和广西等我国南方省份山区的中草药。根据《全国中草药汇编》显示[2]，屈头鸡果可入药，性味甘平，口感颇佳，具有疗肺止咳、生津利喉、解毒清肝功效，用于咳嗽、哮喘，但成年人每日用量为1～2个，不可过量，以防中毒。迄今为止，国内外有关屈头鸡果药用价值的文献资料极少，现存的文献也主要是针对其食入过量导致中毒的报道[3]，目前尚无屈头鸡果治疗哮喘的报道。

本研究显示，屈头鸡果灌胃预处理对哮喘小鼠气道IL-4、IL-5等Th2型细胞因子具有抑制作用，并可激活IL-2、IL-10、IFN-γ等Th1型细胞因子，提示屈头鸡果对哮喘气道炎症具有一定的防治作用，这种防治作用可能是通过抑制Th2型细胞因子、激活Th1型细胞因子来实现的。屈头鸡果对于哮喘气道炎症的抑制作用上，在某些方面虽不及传统的抗炎药物糖皮质激素，但仍具有进一步发掘的药用价值。实验同时也显示，屈头鸡果的治疗剂量和中毒剂量对气道炎症的抑制作用并无显著性差异，但中毒剂量则可导致动物死亡，因此不宜过量食用屈头鸡果。鉴于屈头鸡果有一定毒性，因此目前尚不建议应用于临床。对于屈头鸡果确切的有效药理成分与毒性成分，仍有待今后进一步深入研究。