黄芪总提取液对D—半乳糖致大鼠亚急性衰老模型的影响研究

闫晋晋 杨薪正 姚妙 廖国珍

摘 要：目的：观察黄芪总提取液对D-半乳糖致大鼠亚急性衰老模型的影响。方法：建立D-半乳糖致大鼠亚急性衰老模型，以Y型电迷宫检测其学习记忆能力，分别采用黄嘌呤氧化酶法、TBA比色法测定大脑SOD活性和MDA含量、硝酸还原酶法测定大脑NO含量，观察大鼠服用黄芪总提取液后以上指标的变化。结果：与D-半乳糖模型组相比，黄芪总提取液的中、高剂量组可提高亚急性衰老模型大鼠的学习记忆能力（P<0.05），增加D-半乳糖所致衰老模型大鼠大脑SOD活性、降低MDA含量（P<0.05）。各给药组均起到降低脑组织NO含量，但无法恢复至正常水平。结论：黄芪提取液能改善D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠的多项体征，摄入适量黄芪总提取物可以明显提高大鼠机体抗氧化、抗衰老能力，从而对D-半乳糖诱发的大鼠衰老起到延缓的效果。

关键词：黄芪提取液；D-半乳糖；衰老；大鼠；学习记忆

中图分类号：R339.38 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）28-0005-04

Abstract： Objective： To observe the effect of total extract of astragalus on subacute aging model of rats induced by D-galactose. Methods： The subacute aging model induced by D-galactose was established in rats. The ability of learning and memory was measured by Y-type electric maze. The activity of SOD and the content of MDA in brain were measured by xanthine oxidase method and TBA colorimetry， and the content of no in brain was determined by nitrate reductase method. The changes of the above indexes were observed after taking the total extract of astragalus membranaceus in rats. Results： Compared with D-galactose model group， middle and high doses of total extract of astragalus could improve the learning and memory ability of subacute aging model rats （P < 0.05）， increase the activity of SOD and decrease the content of MDA in brain of aging model rats induced by D-galactose （P < 0.05）. The content of NO in brain tissue was decreased in each treatment group， but it could not recover to normal level. Conclusion： Astragalus membranaceus extract can improve many signs of subacute aging rats induced by D-galactose. Intake of appropriate amount of total extract of astragalus membranaceus can significantly improve the ability of anti-oxidation and anti-aging of rats. Thus D-galactose induced aging in rats play a delayed effect.

Keywords： astragalus membranaceus extract； D-galactose； aging； rat； learning and memory

黄芪是膜荚黄芪（Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.或蒙古黄芪 （Astragalus membenanceus（Fisch.） Bge .Var干燥处理后的块根，属于豆科（Leguminosae）植物黄芪属（Astragalus），文献中记载原名为黄耆，最早发现载于《神农本草经》，用药属上品。中医药典籍《本草纲目》中称：“耆，长也，色黄者黄耆，乃补药之长”[1]。黄芪的功效有祛邪、扶正，历来中医当“补气固表之圣药“使用。黄芪药材中所含化学成分主要有黄酮类、多糖类、皂苷类以及多种氨基酸等。现代医学、药理学、毒理学研究表明，黄芪具有降压利尿、抗衰老、增强人机免疫力、降血糖、抗疲勞、抗肿瘤、镇痛镇静、益智、抗病毒等作用。尤其近年来在现代药理研究日趋成熟，黄芪新的功效及用途被源源不断的发掘[2]。本研究旨在通过试验，观察黄芪药材总提取液对D-半乳糖所致亚急性衰老模型大鼠的学习记忆、大脑中SOD活性、MDA及NO含量的影响，探讨其抗衰老的作用机制，为黄芪进一步开发成为抗衰老的天然植物源性药物及为黄芪药材的全方位综合质量评价提供可供参考的实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

挑选成年Wistar实验大鼠80只，体质健康，雌雄分半，体重均为310±15g，由陕西师范大学生命科学学院实验动物中心提供。合格证号：SCXK（陕）2012-006。分4笼饲养，室温保持在18～25℃，空气湿度保持在40°，大鼠生活环境通风良好，空气新鲜，可自由活动、取食、饮水。

1.2 药品与试剂

黄芪提取液：实验用黄芪采自西北农林科技大学药用植物园，经过廖国珍教授鉴定，取根部经自然干燥，取黄芪根干品500g，置5000ml圆底烧瓶中，加开水3000ml在105℃下持续回流提取1.5h，抽滤，所剩残渣再次加水3000ml持续回流提取3次，每次1h，抽滤，合并所有滤液后浓缩，置真空干燥箱内烘干，所得黄芪药材总水提取物（1.3g生药/ml）备用[2]。试验大鼠的灌胃体积采用0.4ml/20g的标准[3]。

六味地黄丸药液的配制：采用北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂产品（批号：国药准字Z19993068）；购于陕西省西安市 邑区秦渡镇怡康药店。将六味地黄丸5粒置研钵中研磨成细粉后加入超纯水适量，配置成含六味地黄丸药物浓度为0.165g/ml的混悬液，每周用前重新制备一次，在冰箱中4℃下保存，在使用前1h加热至37℃备用。

D-半乳糖（D-gal）：由上海生工生物工程有限公司进口分装；丙二醛（MDA）、超氧歧化酶（SOD）检测试剂盒购自南京市建成生物技术研究所（批号：20090726）。

2 方法

2.1 初步建立D-gal致亚急性大鼠衰老模型[4]

将雌雄各半的60只Wistar大鼠，随机分为六组：（1）D-gal+黄芪提取液高剂量组；（2）D-gal+黄芪提取液中剂量组；（3）D-gal+黄芪提取液低剂量组；（4）D-gal+六味地黄丸药物组；（5）D-gal空白组；（6）正常对照组。（1）、（2）、（3）、（4）、（5）五组采用D-gal致亚急性衰老法造成大鼠亚急性衰老模型。将D-gal 5000mg加于500ml生理盐水中溶解，精确配制成浓度为10mg/ml的注射液，注射剂量设置为130mg/kg.d（即按大鼠每克体重注射0.0130ml D-gal注射液）在大鼠腹腔中部注射，（6）正常對照组使用等体积生理盐水注射，6组大鼠采取每周称重的方式，依据末次称重的体重克数调整给药剂量，连续造模8w。其中（1）D-gal+黄芪提取液高剂量组、（2）D-gal+黄芪提取液中剂量组、（3）D-gal+黄芪提取液低剂量组、（4）D-gal+六味地黄丸药物组大鼠在第2周结束后分别灌胃给药，规格为黄芪提取液0.5g/kg、0.25g/kg、0.1g/kg及六味地黄丸6.5mg/10g；（5）D-gal组大鼠以等量双蒸水给药；（6）正常对照组大鼠采用颈背部皮下注射的方式给予等量生理盐水，并于第2周结束后给予等量双蒸水，以此建立非模型常对照组。

2.2 学习记忆能力检测-Y迷宫法[4]

将大鼠置于等方向辐射式反射箱（三向Y迷宫）。在大鼠被电击后能快速逃跑至安全区规定为1次正确逃离反应，每连续进行10次测验中若有9次（90%）逃离反应正确，则记录为大鼠习得标准。记录（6）正常对照组和（1）、（2）、（3）、（4）、（5）各试验组中每只大鼠达到标准所需的试验次数，用以统计学分析。

2.3 测定大鼠脑组织中的SOD的活性

将试验结束后的大鼠迅速断头处死，获取大脑组织并加入组织匀浆液在冰浴条件下匀浆，采用Bradfor D法准确测定大鼠脑组织中总蛋白的含量。取浓度为1%的大鼠脑组织匀浆液，在波长为545nm处选用黄嘌呤氧化酶法（ SOD检测试剂盒）分别测定（6）正常对照组和（1）、（2）、（3）、（4）、（5）各试验组大鼠脑组织匀浆液的吸光度ASOD。

2.4 测定脑组织中MDA的含量

试验大鼠脑组织蛋白匀浆制备和定量方法均同2.3项下方法。于波长534nm处，用TBA比色法（MDA检测试剂盒）分别测定对照组和各试验组大鼠脑组织匀浆液的吸光度AMDA。

2.5 一氧化氮（NO）含量测定

（1）样品的预处理。称取100mg低温冻存大脑皮质组织，放入体积为0.9ml浓度为0.9% 的NaCl的试管内，在电动匀浆器内运行3min，制备成浓度为10%的组织匀浆，然后在离心机内（3000r/min）离心15min，取上清液备用，采用硝酸还原酶法测定脑组织中NO的准确含量。

（2）配制试剂。试剂盒内7种试剂：试剂1、2在试验前置于37℃水浴中充分溶解；试剂3、4、7保存在室温（25± 2℃）下；试剂5在试验前加入烧沸的双蒸水20ml，充分溶解后在避光阴凉处保存；试剂6在试验前加入常温双蒸水8ml，充分混合后冷藏，并在避光条件下保存；显色剂的配制比例为试剂5：6：7=3：1：1，避光条件下存储；标准应用液配制，取0.1ml标准品，采用双蒸水稀释后定容至15 ml，混匀，即得。

（3）操作方法

混匀，25℃条件下阴凉避光放置10分钟后用双蒸水调零，在波长545nm下采用1.0cm光径，测定各组试剂的吸收度A。

根据以下公式计算脑组织中NO的含量。

2.6 统计学进行数据分析

采用SPSS 22.00版本统计分析软件，比较正常对照组与各试验组之间是否存在显著差异。

3 结果

3.1 黄芪药材总提液对D-gal致衰老模型大鼠的学习记忆能力的影响

试验结果显示，与正常对照组相比较，在D-gal造模6周以后，模型组的大鼠达到习得标准所需要的训练次数呈现极显著增加（P<0.01），而在黄芪总提取液中、高剂量组的大鼠达到习得标准所需要的训练次数呈现出显著低于模型组（P<0.05）的态势。试验结果见表2。

3.2 黄芪总提取液对D-gal所致衰老模型大鼠脑组织中SOD活性和MDA含量的影响

试验结果显示，与正常对照组相比较，在D-gal造模6周以后，模型组的大鼠脑组织中SOD的活性呈现出显著降低的态势（P<0.01），而脑组织中MDA的含量却呈现出极显著升高（P<0.01）的趋势。在与模型组相比较的结果中显示，黄芪总提取液中、高剂量均呈现出使大鼠脑组织中SOD活性显著增加（P<0.05），而MDA的含量显著降低（P<0.05）的趋势。结果见表3。

3.3 黄芪提取液对D-gal致亚急性衰老大鼠脑组织NO的影响

表4的结果显示：

（1）造模6周后，模型对照组与空白对照组相比，大鼠脑组织中NO的含量存在极显著差异（P<0.01），各不同剂量给药组与模型对照组比较，试验结果呈现出显著性差异（P<0.05）。

（2）各不同剂量给药组与空白对照组相比较，各组均呈现出显著性差异（P<0.05）。

（3）黄芪总提取液低、中、高各剂量组之间的药效作用大体无差别，统计学显示为无差异（P>0.05）。

以上结果提示我们，对于D-gal致衰老的大鼠脑组织中NO含量的升高，试验设计的各不同剂量给药组均起到了降低NO的作用，但尚未恢复至健康大鼠的正常水平。黄芪总提取液低、中、高各不同剂量组之间的药效无显著性差异，说明试验设计方面的改进不需要再增加或减少剂量，而黄芪总提取液对NO含量的降低功效很可能是药物发挥抗衰老机制的重要途径之一。

4 讨论

关于衰老的学说，学术界尚未达成共识，其中自由基致衰老学说的观点认为新陈代谢是一切生命现象的本质和基础，衰老是生命有机体发生代谢性障碍导致的结果。糖代谢的紊乱会诱发心、肝、脑、肾等脏器代谢异常，导致生命走向衰老[5]。据此理论，我们设计了动物衰老模型，即在一定的时间段内持续给试验动物大鼠注射一定剂量的D-gal，使机体细胞内的D-gal浓度在规定时间内持续升高，最终D-gal在醛糖还原酶的作用下，生成还原产物半乳糖醇，半乳糖醇在细胞内不能被正常代谢而富集起来，使细胞渗透压增加，体积发生膨胀，从而出现功能障碍、代谢紊乱的现象，此外，生命有机体还呈现出多种抗氧化酶活性下降，机体抗氧化能力降低，大量的活性氧、自由基产生，伴随这一过程的现象还有细胞膜结构受损，过氧化脂质及脂褐素升高，最终导致机体衰老现象的发生。试验表明，用D-gal注射建立亚急性衰老模型大鼠的学习记忆能力降低、活性氧和自由基产物增多、抗氧化降低、免疫力下降，可用于动物行为学、抗氧化能力以及免疫学等学说的抗衰老药物效果研究。本实验采用D-gal注射制备的亚急性衰老大鼠模型结果也显示，D-gal造模后，大鼠的免疫器官开始萎缩，经过测量，血清总蛋白和白蛋白含量下降，脑组织中NO含量上升，充分证明造模大鼠的症状为免疫力明显下降。

生物有机体在新陈代谢过程中会持续的产生多种具有强氧化能力的自由基和活性氧，当富集在细胞内的自由基数量超出机体自身的清除能力时，自由基会诱发一系列的的氧化还原反应，从而直接或间接导致细胞膜脂质受损以及新的交联键的不断产生，导致体内生物化学反应的酶活性降低、引起DNA链非正常断裂、活性多糖被降解、导致机体正常代谢被破坏，表现为各种疾病，同时加速机体衰老，皮肤光泽度下降、老年斑、皱纹等体征开始出现，对机体造成极大的伤害。根据D-gal致衰老造模是根据衰老的代谢学说而制备的一种典型衰老模型，它具有的自由基代谢紊乱特征与自然衰老非常相似，在学术界认为该模型导致的衰老与自然衰老接近[5]。大量的D-gal進入体内后，发生氧化还原反应，生成具有强氧化性的自由基，自由基可引发脂质过氧化的链式反应，细胞膜上的过氧化脂质（LPO）的分解，产生的丙二醛（MDA）与DNA、RNA及蛋白质等物质结合，最终导致细胞膜组份发生变化、功能发生障碍，促进生命机体走向衰老[7]。除此之外，脂质过氧化的产物MDA还可引起机体精神行为变化，通过化学键交联、结合生成脂褐质，诱发神经系统发生功能障碍。近年来，多项研究结果显示[6]，脑组织中MDA的含量随年龄的增加而上升，SOD活性随年龄的增长而下降。SOD在机体代谢中的重要性体现在对保护机体心脑功能、延缓衰老方面具有不可忽视的作用。机体内SOD的活性与生命的长度呈现正相关[8]。

本研究结果显示，经D-gal注射造模后的大鼠学习记忆力显著降低、脑组织中SOD活性显著下降，MDA含量显著增高，表现出明显的生命衰老体征；造模前后对比，D-gal致衰老模型的大鼠脑组织中NO含量显著高于空白对照组的含量，黄芪总提取物低、中、高不同剂量对NO含量有一定程度的降低作用，但各剂量组之间的差异无统计学意义，初步正面黄芪总提取物很有可能是通过抑制组织内NO的升高而产生增强生命机体免疫力的功效。

本研究结果表明，黄芪总提取液可导致D-gal 致衰老模型大鼠的衰老指征发生改变，学习记忆能力提高，SOD活性升高，MDA、NO含量降低。综上，黄芪总提取液具有延缓生命机体衰老的功效，可为开发防神经退行性病变、抗机体衰老的植物源性药物提供一定的参考。

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