人乳头状瘤病毒少见亚型在宫颈病变患者分布状况的研究

李娇 李娜 赵静妮 李琰清 赵思雨 刘宇峰 李雨薇 牛婧 王亚文，★

宫颈癌是全世界女性高发癌症，人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持续性感染是宫颈癌发生的主要病因，约有95%的宫颈癌的发生都与HPV感染有关［1］。中国食品与药品监督管理局（China Food and Drug Administration，CFDA）规定将 13种 HPV 高危亚型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）和5种HPV中等风险亚型（HPV26、53、66、73、82）为与宫颈癌发生相关的常见亚型，并用于常规宫颈癌筛查方案［2］。常见HPV亚型的检测，在健康女性进行宫颈癌筛查及预防方面已见成效。但在临床工作中，仍有一些宫颈病变患者，应用现有HPV检测方法造成漏诊，引发不良结局。其原因与HPV检测方法的局限性［3］及病变病理类型的特殊性有关［4］。本研究将针对HPV检测亚型的数量和方法的限制因素，对HPV常见亚型检测为阴性的宫颈病变患者行HPV少见亚型的检测，以期了解HPV少见亚型的分布情况，并为疾病病因探索及病程随访提供重要补充。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2016年1月至2017年6月在西安交通大学第一附属医院妇科门诊就诊，进行宫颈癌联合筛查女性12 043例。平均年龄（45.81±11.04）岁，年龄范围20～76岁。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 HPV DNA分型检测

①仪器：ABI 2720 PCR扩增仪（美国应用生物系统公司）、凯普医用核酸分子快速杂交仪（凯普生物化学有限公司）。②试剂：人乳头状瘤病毒（HPV）21分型核酸检测试剂盒、人乳头状瘤病毒（HPV）37分型核酸检测试剂盒（PCR+膜杂交法）（凯普生物化学有限公司）。HPV 21分型可检测，包括13种高危亚型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）；6 种低危亚型（HPV6、11、42、43、44、81）。HPV37分型检测试剂盒在 21种分型的基础上新增了16种少见亚型（HPV26、34、40、54、55、57、61、67、69、70、71、72、73、82、83、84）的检测。

1.2.2 病理学诊断

液基细胞自动制片染色系统（安必平医药科技有限公司）及配套宫颈细胞保存液及巴氏染液。

1.3 检测方法

12 043例女性行HPV 21种分型核酸检测以及新柏氏液基细胞学技术（thinprep cytologic test，TCT）检查，TCT为低级别宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及以上病变者行阴道镜，取组织进行病理学检查。病理结果确诊为宫颈病变且HPV 21种基因分型结果阴性患者，行HPV 37种基因分型补充检测。

1.3.1 HPV DNA核酸检测及分型

①DNA分离提取：按照DNA分离提取试剂盒说明书进行DNA提取及扩增。②导流杂交：采用核酸分子快速杂交仪及配套试剂盒，按试剂盒说明书进行导流杂交，酶标显色。③结果判读：检测结果为清晰可见的蓝紫色圆点。Biotin对照点和内对照点为阳性，判定结果有效。

1.3.2 宫颈细胞及组织病理检查

根据2014年子宫颈细胞学Bethesda报告系统（the Bethesda System，TBS）诊断标准［5］，病理科医生双人对检测结果进行判读，本研究以检测结果为不明意义非典型细胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）、低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）及浸润性宫颈癌（invasive cervical cancer，ICC）患者为研究对象。

1.4 统计学方法

应用SPSS 18.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用例数和百分率（%）描述。按照HPV检测方法分为HPV 21分型、HPV 37分型组；按照宫颈病变诊断分为ASCUS、LSIL、HSIL、ICC组。各组间率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈病变患者的HPV感染分布状况

本研究12 043例行宫颈癌筛查的女性，共筛查出793例宫颈病变患者，其HPV阳性率为74.27%（589/793），各组HPV阳性率分别为ASCUS组 46.23%（43/93）；LSIL组 71.13%（138/194）；HSIL组 76.41%（217/284）；ICC组 86.04%（191/222）各组间阳性率差异具有统计学意义（P=0.001）。对204例HPV 21分型检测阴性的患者行HPV 37分型检测，研究流程及各流程患者HPV感染分布状况如表1所示。

2.2 HPV 37分型在宫颈病变患者的分布状况

本研究204例行HPV 37分型检测的患者，阳性率为22.06%（45/204），HPV 37分型在不同宫颈病变下的检测结果及累积阳性例数与阳性率如表2所示。37分型补充检测使宫颈病变患者HPV总阳性率增加5.67%（45/793），提高至79.95%（634/793）。2种HPV检测结果在各组阳性率分布状况如图1所示。

表1 研究流程及患者HPV感染分布状况（n）Table 1 Study flow and patient flow included in the study（n）

表2 HPV 37种分型基因芯片的检测结果Table 2 Results of 37 types of HPV gene chip tests

图1 HPV 21分型与HPV 37分型在不同宫颈病变的感染分布状况Figure 1 Distribution of HPV 21 and HPV 37 genotypes in different cervical pathological groups

2.3 少见亚型在宫颈病变的分布情况

45例HPV 37分型检测的阳性样本中，22例为HPV 21分型检测已包含型别，其中单一感染14例，多重感染8例。单一感染以HPV16、52、58、39为主；多重感染中，4例为常见亚型感染，4例为少见亚型和常见亚型混合感染。本研究检测出8种少见亚型，检出率分别为HPV54型，3.43%（7/204）；HPV82型，2.45%（5/204）；HPV84型，2.45%（5/204）；HPV61型，1.96%（4/204）；HPV83型，1.47%（3/204）；HPV26 型，1.47%（2/204）；HPV34型，0.98%（2/204）；HPV40型，0.49%（1/204）。其他少见亚型未被发现。各亚型在不同宫颈病变的分布如表3。其中单一感染35例，多重感染10例，多重感染分布状况如表4。

表3 少见亚型在HPV阴性宫颈病变患者的感染分布状况Table 3 Distribution of infection of HPV rare subtype in patients with HPV-negative cervical lesions

表4 不同宫颈病变下HPV多重感染分布状况Table 4 Distribution of multiple infections of HPV in different cervical lesions

3 讨论

本研究在广泛应用HPV 21分型检测进行宫颈癌普遍筛查时，发现部分宫颈癌患者HPV检测结果阴性，其发生率比既往报道多，因此，选用HPV 37分型对HPV 21分型阴性的宫颈病变患者做进一步检查，证实了部分患者漏诊的现状。其原因在于HPV 37分型具有更高的灵敏度，且可以检测出更多HPV亚型。在进行HPV 37分型检测中，仍有22例为HPV 21分型已包括亚型，而在HPV 21分型检测中未检测出来，其原因可能是病毒载量低于HPV 21分型的检测下限，或HPV 21分型检测对于某些亚型的扩增效率略低［6］。HPV 37分型相比普通筛查的型别多，可排除由于检测型别限制造成的假阴性［7］。虽然对人群进行HPV常见亚型的普筛，既可以筛出高风险人群，又可以减少患者由于致病性不高的亚型感染造成的过度恐慌，但对于已经确诊的患者，其HPV检测结果对病因探索、治疗和随访至关重要。

研究发现宫颈癌的发生90%左右都与HPV感染相关［8-9］，一项全球流行率研究报告称，13.0%的鳞状细胞癌和28.2%的罕见宫颈腺癌HPV阴性，并估计常规HPV检测可能会漏掉3%～4%的宫颈癌［10］。目前研究已经公认，所有已建立和验证的针对高危型HPV感染的筛查方案，会错过1%～2%与非高危型HPV感染有关的宫颈癌［11］。本研究发现宫颈癌患者有2.45%因为型别限制未被检出，与以上结论相一致，而宫颈癌前病变的患者有5.67%在初筛时未被检出，且具有更高的未检出率。本研究认为对高危型HPV阴性的宫颈病变患者行少见亚型的检测，可以为更多患者提供临床监管的机会，并成为临床鉴别诊断宫颈癌的必要手段。

在对HPV少见亚型分型的研究中，共发现8种少见亚型的感染。与国内外研究相比，罗招云等［6］对285例HPV 21分型未能检出HPV型别者行37分型检测，成功分型251例。Igidbashian等［12］对HPV 37例宫颈癌的患者研究表明，31.1%患者在利用HC2检测高危型HPV为阴性结果，其中包括1例低危型HPV阳性和1例少见亚型HPV69/71阳性。Petry等［13］在 371例宫颈癌患者中发现31例高危型HPV检测结果为阴性，进一步检测发现有少见亚型1例HPV53、1例HPV71及3例HPV73的感染。以上研究表明，HPV“阴性”的宫颈癌中，存在因为检测型别的限制而导致的HPV检测假阴性，各研究检测出的少见亚型型别各不相同，其原因可能与HPV分布的地域特点及HPV少见亚型的感染本就是小概率事件有关，但都证明了宫颈癌患者中存在HPV少见亚型感染。本研究对象为ASCUS及以上病变患者，比单纯宫颈癌患者研究面更广，感染HPV型别种类更多，且多重感染率更高，可以推测HPV少见亚型虽没有HPV高危亚型致癌率高，但仍有一定的致癌性，是宫颈病变发生的原因之一。

本研究仍有159例宫颈病变患者未检出HPV感染，其HPV感染状况以及特殊的发病机制仍需进一步验证。其原因可能与病毒复制缓慢、异常细胞过少或者严重的细胞受损，使病毒载量过低等因素造成的假阴性有关［14］。也可能与特殊病理类型所致非HPV感染所致宫颈癌有关［15］。HPV检测在对疾病病因诊断中仍有局限性，需要临床工作者进一步研究其特殊病理类型的致癌机制。

综上所述，本研究认为HPV“阴性”的宫颈癌可能因为漏诊，而导致的监管和治疗不及时，应该加强对此部分患者检验方法的弥补。另外，是否存在非HPV感染导致的宫颈癌发生的特殊致病机制，尚需要大量流行病学深入研究。对HPV检测结果为阴性的宫颈病变患者进行少见亚型的检测，是对原有方法的有效补充，将对该类患者的病因探索、诊断治疗以及疾病随访提供补充依据。