虎杖苷对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠溃疡性结肠炎的作用及其对Hedgehog通路影响

吕婷婷， 杨 雷， 沈 磊

武汉大学人民医院消化内科 消化系统疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是指一组病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。近50年来，随着人民生活水平改善和临床诊断水平的提高，UC的发病率持续增长，从(8～14)/10万增加到(120～200)/10万，CD发病率从(6～15)/10万增加到(50～200)/10万[1]。虎杖苷作为一种植物多酚类药物，具有较强的抗炎、抗氧化药理学作用[2]，有研究[3]表明，虎杖苷能够通过上调Hedgehog信号通路来发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡作用。目前尚无实验研究虎杖苷在小鼠急性UC中对Hedgehog信号通路的影响，本课题拟探讨虎杖苷对葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)诱导的UC的作用及其对小鼠结肠组织中Hedgehog通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料雄性C57BL/6J小鼠30只，SPF环境下饲养，6～8周龄，体质量为(22±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。DSS相对分子质量为35 000～50 000，购自美国MP公司。虎杖苷(纯度≥98%)购自北京百灵威科技有限公司。PCR反转录试剂盒购自美国Sigma公司，抗Gli1蛋白一抗购自美国艾博抗有限公司。

1.2实验分组30只小鼠采用随机数字表法分成空白组、模型组、虎杖苷低、中、高干预组(15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg)，每组6只，SPF环境下饲养。造模：模型组及药物干预组小鼠每天自由饮用质量浓度为30 g/L的DSS溶液，空白组小鼠每天予正常饮水。药物干预：空白组正常饮水同时予质量浓度为9 g/L的生理盐水，腹腔注射7 d；模型组造模同时予含质量浓度为9 g/L生理盐水，腹腔注射7 d；药物干预组造模同时分别予虎杖苷 15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg,腹腔注射7 d。

1.3疾病活动度评分每天记录每组小鼠体质量、大便性状及便血情况，计算疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分(见表1)。

表1 疾病活动度评分Tab 1 Disease activity index score

1.4取材实验7 d后小鼠颈椎脱臼处死，迅速解剖，取小鼠全部结直肠及回盲部，测量结肠长度；取病变明显处结肠组织标本(约5 mm×10 mm)，质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行HE染色，剩余结肠组织冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.5组织病理学评分通过HE染色切片观察结肠黏膜形态。参照Cooper等的组织学评分标准(见表2)。

表2 病理组织评分Tab 2 The histological tissues score

1.6结肠炎性因子RT-PCR检测取-80 ℃冰箱中保存的结肠组织，重量约为100 mg，加入Trizol试剂，用匀浆器研磨成浆，移至无RNase的EP管中裂解。加入氯仿，剧烈颠倒混匀数次，室温放置5 min，离心15 min，转移上层水相于另一新EP管中，加入异丙醇，混匀后室温静置10 min。离心10 min，管底可见白色的RNA沉淀。弃上清，加入无RNase的质量浓度为750 g/L的乙醇1 ml，涡旋混匀后，离心5 min。弃上清，空气中干燥RNA沉淀5～10 min，将沉淀溶于20 μl DEPC水中。取溶解后的RNA 2 μl用微量分光光度计测定RNA的纯度和浓度。在逆转录反应体系中将RNA逆转录成cDNA，cDNA 10倍稀释，实时荧光定量RT-PCR检测，绘制溶解曲线，引物序列见表3。

1.7结肠组织细胞核内Gli1蛋白表达检测Western blotting检测结肠组织细胞核内Gli1表达水平。取留存的结肠组织匀浆离心制成细胞裂解液，而后进行SDS-PAGE，采用硝酸纤维膜转膜，再用质量浓度为50 g/L的封闭液(质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉的TBST)封闭1 h，以TBST洗涤3次，每次洗涤5 min。用加入含一抗Gli1和β-actin封闭液室温孵育过夜，TBST洗涤3次，每次洗涤5 min。加辣根过氧化物酶耦联的二抗(1∶10 000稀释)，室温作用1 h，TBST洗涤3次，每次洗涤5 min，以显色液显色。显色后摄片，采用计算机图像软件进行灰度分析，测定灰度值。

表3 引物设计Tab 3 PCR primers

2 结果

2.1DAI评分造模过程中，空白组小鼠体质量均无降低，无潜血阳性，模型组小鼠体质量下降明显，在2～3 d开始出现潜血试验阳性，3～4 d开始出现便血，并逐渐加重，DAI评分较高；药物干预组体质量、便血情况较模型组程度轻(P<0.05)(见图1A)。

2.2结肠长度改变与空白组比较，模型组小鼠结肠长度明显缩短(P<0.05)；与模型组比较，虎杖苷治疗中、高剂量干预组结肠长度均显著变长(P<0.05);(见图1B～1C),低剂量组结肠长度无显著变化(P>0.05)。

2.3小鼠结肠组织病理学评分模型组小鼠结肠黏膜结构不完整，肠绒毛变薄，黏膜及黏膜下层出现大量炎性细胞浸润，周围腺体排列紊乱，上皮及隐窝破坏明显；虎杖苷低、中、高剂量干预组小鼠结肠黏膜及肠绒毛结构较模型组破坏轻，结肠黏膜结构大致完整。病理组织学评分显示：与空白组比较，模型组评分显著升高(P<0.01)；与模型组比较，虎杖苷低、中、高剂量干预组评分均显著降低(P<0.05)(见图2)。

注：与DSS组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与DSS组比较，*P<0.05,**P<0.01。

2.4小鼠结肠炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-17表达与空白组比较，模型组结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-17含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，虎杖苷中、高剂量干预组结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-17含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01),低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图3)。

注：与DSS组比较，*P<0.05,**P<0.01。

2.5小鼠结肠组织内的Hedgehog信号通路的改变

Hedgehog信号通路下游直接转录因子Gli1改变,与空白组比较，模型组结肠组织Gli1 mRNA水平及蛋白水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，虎杖苷中、高剂量组结肠组织细胞中Gli1 mRNA水平和蛋白水平明显升高(P<0.01),低剂量组无显著变化(P>0.05)(见图3～4)。

注：与DSS组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

在临床上IBD药物治疗主要包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和抗TNF-α生物制剂等[4]，近年来研究证实，中药制剂对IBD也有较好的治疗作用，并可长期服用。虎杖苷(3,4,5-三羟基-3-β-D-单葡萄糖苷)是从中药虎杖的根茎中提取的第4种单体,是白藜芦醇与葡萄糖的结合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和改善微循环、保护线粒体功能等药理学作用[2]。本实验通过对我国中药虎杖苷在IBD中疗效及机制的研究，为虎杖苷在IBD中的治疗作用提供科学的理论基础。

TNF-α、IL-1β、IL-6作为肠道炎症反应中的主要促炎因子，其激活能引起肠道炎症的级联放大反应，导致机体的局部炎症和免疫系统紊乱[5-6]。在肠道炎症自我平衡中，来自于固有免疫细胞系促炎细胞因子(例如IL-1β、 IL-6、IL-23)和效应T细胞系(例如Th1和Th17)的促炎细胞因子常维持在稳定的平衡中，而在IBD患者肠道内，该平衡往往被打破，固有免疫细胞和效应T细胞常常产生大量的促炎细胞因子。抗原提呈细胞产生IL-23与Th17细胞的分化、扩增和稳定密切相关，固有CD4+Th17细胞能够在TGF-β、IL-6和IL-1β环境下诱导IL-23受体的表达，IL-23作用于该受体激活Th17细胞的分化并分泌包括IL-17在内的促炎因子[7]，IL-23/IL-17不仅参与肠道微生物的防御[8]，在多种IBD模型中，如CD4+CD45RBhi 转移模型、IL-10-/-结肠炎模型中，DSS诱导结肠炎模型和TNBS诱导结肠炎模型中均高表达，而抗IL-23治疗能够预防并治疗结肠炎症状[9]。在通过虎杖苷干预DSS诱导的急性UC小鼠后，其症状较模型组明显减轻，且肠道的炎症反应明显低于模型组。与DSS诱导的模型组相比，虎杖苷干预组的小鼠DAI评分显著降低，结肠缩短程度降低，结肠组织病理学评分显著降低，RT-PCR检测结肠组织炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-17明显降低，对肠道炎症反应有明显的改善作用，对小鼠急性UC有治疗作用。虎杖苷通过降低结肠组织内固有免疫细胞系的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平和效应T细胞系IL-23/IL-17促炎信号而发挥明显的抗炎作用，明显缓解小鼠结肠炎症状。

Hedgehog信号通路作为胃肠道的胚胎发育过程中重要部分，其主要参与哺乳动物早期胃肠道器官的发育和形成，能够保证消化道正常的轴向分化方向，近年来，越来越多的证据表明，Hedgehog信号通路参与成人急性上皮损伤和肠道慢性炎症反应[10]，并与IBD的发病有很大的关联，该通路在成人的结肠中主要靶细胞为树突状细胞和巨噬细胞[11]，降低50% Hh信号通路能够导致自发结肠炎的发生，通过沉默Gli1+/-基因引起Hedgehog信号通路下调，可导致小鼠对DSS诱导的UC易感性增加，其机制可能是由于该通路明显上调IL-23/IL-17信号，同时促进肠道主要的炎性因子，如IL-1β、IL-6和一些CC、CXC型细胞因子的表达[12]。在多种动物模型中均表明虎杖苷可通过Hedgehog信号通路来发挥抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用，本实验进一步探讨在急性UC小鼠中虎杖苷抗炎作用与Hedgehog信号通路的关系。细胞核内Gli1作为Hedgehog信号通路的直接转录因子，其表达水平可直接反映该通路的活化水平，在经虎杖苷药物干预后，与模型组相比，结肠组织细胞核的Gli1蛋白水平明显升高，说明虎杖苷可能通过上调Hedgehog信号通路水平来发挥抗炎作用，Hedgehog信号通路的激活可通过固有免疫和适应性免疫进一步降低TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-23/IL-17促炎信号。

本研究表明，虎杖苷对DSS诱导的急性UC有较好的治疗作用，其抗炎作用可能与上调Hedgehog信号通路有关，这不仅研究了虎杖苷对IBD的治疗作用，也对治疗机制提供了理论基础。