阿托伐他汀调控MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达对胃癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

王 玲，周巧直 ，王晓燕，吴云娜，樊爱平

首都医科大学附属北京友谊医院 1.药剂科； 2.消化科，北京 100050； 3.北京卫生职业学院； 4.北京大学人民医院药剂科； 5.首都医科大学附属北京中医医院药剂科

胃癌是威胁人类健康的第二大恶性肿瘤，具有发病隐匿、易转移和高复发等特点[1]。我国是胃癌的高发区，其新发病例和死亡率分别占全部恶性肿瘤的17%和20%，且发病呈年轻化趋势，严重威胁着我国人民的身体健康和生活质量[2-3]。阿托伐他汀是一种他汀类药物，除了有降脂作用外，还具有改善内皮功能、抗炎和抗氧化等功效。近年来研究发现，阿托伐他汀对前列腺癌、膀胱癌和头颈癌等多种肿瘤的生长具有一定的抑制作用[4-6]，但其对胃癌细胞生长的影响及其机制的研究未见报道。因此，本研究以SGC-7901细胞为研究对象，探讨阿托伐他汀对胃癌细胞增殖凋亡的影响，并初步探讨其作用机制，为阿托伐他汀在胃癌的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1主要材料胃癌SGC-7901细胞购自上海生命科学院生物化学与细胞研究所，阿托伐他汀购自辉瑞制药公司，胎牛血清、RPMI-1640培养液、青/链霉素、DMSO和MTT试剂购自美国Sigma公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠IgG(IgG-HRP)抗体、MMP-9抗体、 Bcl-2抗体、Bax抗体、β-actin抗体和Cleaved caspase-3抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2细胞培养先将冻存的胃癌SGC-7901细胞水浴溶解，再转移至加入RPMI-1640培养液的离心管中离心，以1 000 r/min离心5 min,弃上清液后加入RPMI-1640培养液(含青/链霉素和质量浓度为100 g/L胎牛血清)进行培养，培养在体积分数为5%的CO2、37 ℃恒温培养箱中，以质量浓度为2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，每3 d传代1次。收集对数生长期的细胞进行实验。

1.3MTT法检测SGC-7901细胞增殖收集对数生长期的SGC-7901细胞，胰蛋白酶消化后，细胞计数，按每孔100 μl(细胞浓度为1×104个/ml)接种到96孔板中培养。随机分为4组，每组设置5个复孔，分别加入终浓度为0、20、60和100 μmol/L阿托伐他汀，各组在培养24、48、72 h后，向每孔加入20 μl浓度为5 g/L 的MTT溶液，培养4 h后，弃培养液，加DMSO 100 μl，反应20 min。以不含阿托伐他汀的细胞作为对照组，以空白孔调零，在570 nm波长处酶标仪检测各组细胞的吸光度(A)值，计算细胞抑制率。公式：抑制率(%)=100%×[ (A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白组)]。

1.4流式细胞仪检测SGC-7901细胞周期和凋亡取1.3中经0、20、60和100 μmol/L的阿托伐他汀作用48 h的SGC-7901细胞，以磷酸缓冲液洗涤后，经胰蛋白酶消化，制备细胞悬液。调整细胞浓度为6×104个/ml。分别收集两份体积为1 ml的各组细胞悬液，磷酸缓冲液洗涤后，1份中先加入70%乙醇(预冷)固定细胞过夜，以1 000 r/min离心5 min,弃上清液，以磷酸缓冲液洗涤后，加入PI染液1 ml，避光下处理30 min后，上流式细胞仪检测各组细胞周期的变化。另1份离心后，先加入Binding Buffer缓冲液500 μl，再加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC，避光反应15 min后，上流式细胞仪检测检测各组细胞的凋亡率。其中，每组实验均重复3次。

1.5Westernblotting检测MMP-9、CleavedCaspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达收集1.3中阿托伐他汀作用48 h的各组SGC-7901细胞，以磷酸缓冲液洗涤后，加入细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，并以试剂盒定量总蛋白浓度。将5×Loading buffer与总蛋白混匀后，沸水浴变性。取变性蛋白80 μg上样至SDS-PAGE凝胶中电泳。分离完毕后，取出凝胶，按照湿转法转印，接着取出PVDF膜置于TBST(含质量浓度为50 g/L脱脂奶粉)封闭液中处理2 h，加入500倍稀释的一抗(MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin抗体)和2 000倍稀释的IgG-HRP二抗，充分反应后，以化学发光剂ECL显影，Image软件计算各目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1阿托伐他汀对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响不同浓度的阿托伐他汀(20、60和100 μmol/L)处理胃癌SGC-7901细胞24、48和72 h后，均对SGC-7901细胞生长产生了抑制作用，并随着阿托伐他汀浓度的增加及作用时间的延长，其抑制效果越明显。同时间点，不同浓度组间细胞抑制率差异有统计学意义(P<0.05)；同一浓度，不同作用时间点细胞抑制率差异也均有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 阿托伐他汀对胃癌SGC-7901细胞抑制率的影响Tab 1 Effect of Atorvastatin on the inhibitory rate of SGC-7901 cells in gastric cancer %

注：同时间，a：与20 μmol/L比较，t24h-60=7.888，P=0.000；t48h-60=5.361，P=0.002；t72h-60=3.289，P=0.017；t24h-100=13.373，P=0.000；t48h-100=12.569，P=0.000；t72h-100=7.111，P=0.000；同时间，b：与60 μmol/L比较，t24h=5.485，P=0.002；t48h=7.209，P=0.000；t72h=3.822，P=0.009；同浓度，c：与24 h比较，t20-48h=7.588，P=0.000；t20-72h=11.694，P=0.000；t60-48h=2.256，P=0.065；t60-72h=5.927，P=0.001；t100-48h=1.711，P=0.138；t100-72h=3.975，P=0.007； 同浓度，d：与48 h比较，t20=4.106，P=0.006；t60=3.671，P=0.010；t100=2.265，P=0.064。

2.2阿托伐他汀对胃癌SGC-7901细胞周期的影响经不同浓度阿托伐他汀(0、20、60和100 μmol/L)处理胃癌SGC-7901细胞48 h后，流式细胞仪检测各组细胞的周期变化(见表2)。随着阿托伐他汀浓度的增加，G0/G1期细胞所占比例逐渐升高，S期和G2/M期细胞比例逐渐降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 阿托伐他汀对胃癌SGC-7901细胞周期的影响Tab 2 The effect of Atorvastatin on the cell cycle of gastric cancer SGC-7901 %

注：a：与0 μmol/L组相比，tG0/G1-20=9.037，P=0.000；tS-20=6.960，P=0.000；tG2/M-20=5.212，P=0.001；tG0/G1-60=13.007，P=0.000；tS-60=9.469，P=0.000；tG2/M-60=8.279，P=0.000；tG0/G1-100=17.170，P=0.000；tS-100=12.721，P=0.000；tG2/M-100=10.615，P=0.000；b：与20 μmol/L组相比，tG0/G1-60=3.970，P=0.000；tS-60=2.509，P=0.037；tG2/M-60=3.068，P=0.015；tG0/G1-100=8.133，P=0.000；tS-100=5.761，P=0.000；tG2/M-100=5.403，P=0.001； c：与60 μmol/L组相比，tG0/G1=4.163，P=0.003；tS=3.253，P=0.012；tG2/M=2.336，P=0.048。

2.3阿托伐他汀对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响经不同浓度阿托伐他汀(0、20、60和100 μmol/L)处理胃癌SGC-7901细胞48 h后，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况(见图1和表3)。与0 μmol/L组相比，20 μmol/L组、60 μmol/L组和100 μmol/L组细胞的凋亡率均显著升高(P<0.05)，且SGC-7901细胞的凋亡率呈浓度依赖性增加(P<0.05)。

注：1: 0 μmol/L; 2: 20 μmol/L; 3: 60 μmol/L; 4: 100 μmol/L

注：a：与0 μmol/L比较，t20=3.490，P=0.008；t60=6.072，P=0.000；t100=10.396，P=0.000；b：与20 μmol/L比较，t60=2.582，P=0.033；t100=6.906，P=0.000；c：与60 μmol/L比较，t=4.324，P=0.003。

2.4阿托伐他汀对胃癌SGC-7901细胞中MMP-9、CleavedCaspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响Western blotting进一步探讨阿托伐他汀处理后胃癌SGC-7901细胞中MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况(见图2和表4)。结果显示，经不同浓度阿托伐他汀干扰后，细胞中MMP-9和Bcl-2蛋白的表达均随阿托伐他汀浓度的增加而下降，而Cleaved Caspase-3和Bax蛋白的表达则呈浓度依赖性上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

他汀类药物是一类常用的调脂药，通过阻断与细胞周期及代谢凋亡密切相关的甲羟戊酸代谢途径影响细胞的增殖、分化和凋亡，进而发挥抗肿瘤的作用[7]。

表4 阿托伐他汀对MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响Tab 4 The effect of Atorvastatin on the expressions of MMP-9, Cleaved Caspase-3, Bcl-2 and Bax proteins

注：a：与0 μmol/L比较，t20-1=5.945，P=0.000；t20-2=3.538，P=0.008；t20-3=5.970，P=0.000；t20-4=3.770，P=0.006；t60-1=13.212，P=0.000；t60-2=9.254，P=0.000；t60-3=12.792，P=0.000；t60-4=6.875，P=0.000；t100-1=17.175，P=0.000；t100-2=13.336，P=0.000；t100-3=15.351，P=0.000；t100-4=10.201，P=0.000；b： 与20 μmol/L比较，t60-1=7.266，P=0.000；t60-2=5.716，P=0.000；t60-3=6.822，P=0.000；t60-4=3.105，P=0.015；t100-1=11.230，P=0.000；t100-2=9.798，P=0.000；t100-3=9.381，P=0.000；t100-4=6.431，P=0.000；c： 与60 μmol/L比较，t1=3.964，P=0.004；t2=4.083，P=0.004；t3=2.558，P=0.034；t4=3.327，P=0.010。

1: 0 μmol/L; 2: 20 μmol/L; 3: 60 μmol/L; 4: 100 μmol/L

阿托伐他汀是他汀类药物中应用最广泛的一种，近年来阿托伐他汀的抗肿瘤作用也越来越多引起关注。据报道，阿托伐他汀能够通过将细胞阻滞于G0/G1期及抑制COX-2蛋白表达抑制肝癌HepG2细胞增殖[8]；还可以通过调控PI3K/ATK/mTOR信号通路抑制白血病HL-60细胞增殖和诱导细胞凋亡[9]。还有研究[10-11]发现，阿托伐他汀能够呈剂量依赖性抑制结肠癌HCT-116、SW-480及Caco-2细胞的生长；通过抑制RhoA活性抑制非小细胞肺癌细胞增殖。近年来发现，他汀类药物对胃癌有一定的预防作用，而其对胃癌细胞生长的影响未见报道[12]。因此，研究阿托伐他汀对胃癌细胞生长的影响，对胃癌的治疗具有重要意义。本研究，以不同浓度阿托伐他汀(20、60和100 μmol/L)处理胃癌SGC-7901细胞后发现，阿托伐他汀能够呈时间-浓度依赖性抑制SGC-7901细胞增殖，诱导细胞G0/G1期阻滞并促进细胞凋亡。提示，阿托伐他汀的抗胃癌作用可能与诱导G0/G1期细胞阻滞有关。

基质金属蛋白酶(MMPs)是水解基质和质膜中各种弹性蛋白酶和胶原酶的一类蛋白裂解酶，在降解血管基底膜、重塑外基质，促进肿瘤细胞侵袭和迁移等方面发挥着重要作用。MMP-9是MMPs家族中研究较多的成员，其在胃癌组织中的表达明显高于邻近健康组织，与肿瘤节点转移分期、淋巴结转移等有着密切关系[13]。Bcl-2家族在细胞凋亡的线粒体途径中发挥着重要作用，Bcl-2和Bax是该家族中的重要成员，分别发挥抑癌基因和促癌基因的作用，两者通过形成异源二聚体调节转录活性，Bcl-2/Bax值决定了细胞生长或凋亡。Bcl-2表达增加和Bax表达下降可能是胃癌细胞凋亡受到抑制的重要原因[14]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)系列级联切割过程是细胞凋亡的重要执行过程，切割激活Caspase-3酶原后，活化的Caspase-3发挥调控作用，引起细胞凋亡。Caspase-3表达水平有可能是晚期胃癌治疗和生存不良反应的一个重要预测指标[15]。有研究[16]指出，他汀类药物可能通过调控MMP-9、Caspase-3、Bcl-2和Bax等基因发挥抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和诱导细胞凋亡。为了进一步观察阿托伐他汀抗胃癌的分子机制，本研究采用Western blotting检测阿托伐他汀处理48 h后的SGC-7901细胞中MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果发现，细胞中MMP-9和Bcl-2蛋白的表达均随阿托伐他汀浓度的增加而下降，而Cleaved Caspase-3和Bax蛋白的表达则呈浓度依赖性上升。提示，阿托伐他汀可能通过上调Cleaved Caspase-3和Bax蛋白和下调MMP-9和Bcl-2蛋白的表达发挥抗胃癌的作用。

综上所述，阿托伐他汀能够抑制胃癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，其作用机制可能与诱导细胞G0/G1期阻滞、上调Cleaved Caspase-3和Bax蛋白和下调MMP-9和Bcl-2蛋白有关。有研究[17-18]指出，阿托伐他汀与塞来昔布、吡格列酮等药物联用可以增强其抗肿瘤作用，后期还需对阿托伐他汀与其他药物联用抗胃癌作用进行研究，以期为胃癌的治疗提供了新的方向，为胃癌以阿托伐他汀为基础临床治疗奠定理论基础。