激活腺苷酸活化蛋白激酶 α在苯扎贝特抑制氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞炎症中的作用

李 骞，张 强，叶伟祥，黄志坚，李秀研

（福建医科大学附属泉州第一医院老年病科，福建泉州 362000）

心血管疾病已成为死亡的最常见原因［1］。在中国，每年有300万人死于心血管疾病，占死亡总人数＞40%［2］。心血管疾病的高发病率以及高死亡率造成严重的家庭和社会问题。动脉粥样硬化（athero⁃scleros，AS）是常见的心血管疾病。研究证实，血管内皮功能障碍是AS以及多种心血管疾病发生发展的重要环节［3］。研究表明，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）诱导血管内皮细胞产生的炎症是导致AS发生的重要环节［4］，提示通过抑制ox-LDL诱导的内皮细胞炎症可能是防治AS及其他心血管疾病的重要途径。

腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophos⁃phate activated protein kinase，AMPK）不仅是细胞能量代谢的重要调节酶，而且在细胞炎症病理反应中也具有重要的调节作用［5］。AMPK激活后可显著抑制NF-κB的激活，降低炎症因子表达以及降低炎症细胞的迁移与粘连，是一种对细胞炎症反应起关键调节作用的靶点［6］。AMPK是由一个催化亚基（α）和2个调节亚基（β和γ）组成的三聚体酶复合物，其中AMPKα的作用最为关键。研究表明，目前临床广泛使用的抗AS治疗的药物，如二甲双胍能通过激活AMPK发挥保护心血管的作用［7］，还可显著抑制脂多糖诱导的巨噬细胞肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达［8］，此外，敲除AMPK可诱导血管内皮功能障碍和炎症［9］。因此，AMPKα可能是血管内皮炎症导致的心血管疾病特别是AS疾病的一个潜在的关键治疗靶点。

苯扎贝特（bezafibrate，BZF）是一种过氧化体增殖物激活型受体α（peroxisome proliferatorsactivated receptor-α，PPAR-α）的激活物，具有改善细胞线粒体功能和能量代谢的作用［10］。临床研究发现，BZF可以用于抗AS的治疗［11］。动物实验也表明，BZF能明显改善高脂饮食导致的小鼠的AS症状［12］。与此同时，也有研究表明，BZF通过激活PPAR-α蛋白在内皮细胞中发挥抗炎作用［13］。然而，目前未见关于细胞炎症反应关键调节靶点AMPKα在BZF抗ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）炎症反应中作用的研究报道。本研究采用ox-LDL诱导HUVEC炎症模型，探索AMPKα在BZF抑制ox-LDL诱导HUVEC炎症中的作用，进一步明确BZF防治内皮细胞炎症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

EBM-2内皮细胞基础培养基套装（货号：CC-3162）购自瑞士Lonza公司；BZF（货号：213579，纯度＞98%）购自百灵威科技；AMPKα抑制剂Compound C（CC）（货号：HY-13418A，纯度＞98%）购自美国MCE公司；氧化低密度脂蛋白（货号：YB-002，2 g·L-1）购自广州奕源生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒（货号：9767）、逆转录试剂盒（货号：RR047A）和荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（货号：638319）购自日本TAkARa生物技术有限公司；TNF-α、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）的引物由美国Invitrogen公司合成；BCA蛋白定量试剂盒（货号：A53225）和ECL显影剂（货号：32106）购自美国Thermofisher公司；兔抗p-AMPKα（Thr-172，货号：50081）、AMPKα（货号：5832）、p-P65（Ser-536，货号：4886）和P65（货号：8242）多克隆抗体购自CST公司；兔抗GAPDH单克隆抗体（货号：ab181603）购自美国Abcam公司；小鼠抗TNF-α单克隆抗体（货号：BF0170）、兔抗IL-6（货号：DF6087）、ICAM-1（货号：AF6088）和VCAM-1（货号：DF6082）多克隆抗体购自美国Affinity公司。

1.2 HUVEC来源、培养和分组处理

原代HUVEC购自加拿大Cell Applications公司（货号：S200K-05n），用Lonza公司的EBM-2内皮细胞基础培养基套装，在37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，取第3～4代进行实验。药效实验分组为细胞对照组、ox-LDL 50 mg·L-1组、BZF 25，50 和100 μmol·L-1组。药物实验分组：细胞对照组，BZF 25，50 和 100 μmol·L-1组。验证实验分组：细胞对照组、ox-LDL 组、BZF 100 μmol·L-1组和 BZF 100 μmol·L-1+CC 5 μmol·L-1组。以上分组药物均为同时加入并作用24 h。

1.3 荧光定量PCR检测 TNF- α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达水平

采用MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒提取细胞总RNA。采用PrimeScript™RT Master Mix进行逆转录反应，操作按试剂盒说明书进行。采用Integrated DNA Technologies公司的在线工具设计引物，退火温度（Tm）值均为60℃，引物序列见表1。采用SYBR®Fast qPCR Mix进行qPCR，反应在Roch480型实时qPCR系统中进行，每组实验重复3次。以GAPDH作为内参，反应结束后通过分析Ct值，采用 2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。

Tab.1 Sequence of primers

1.4 Western蛋白印迹法检测TNF- α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1，p-P65，P65，p-AMPK 和 AMPK α 表达水平

分组处理细胞24 h后，PBS洗1次，加入适量的RIPA裂解液裂解，提取总蛋白用BCA蛋白定量试剂盒定量，样品加入缓冲液，100℃，5 min变性，总蛋白上样量为20 μg，用10%的SDS-PAGE电泳分离，半干电转法将蛋白质转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉于37℃封闭1 h后，分别用相应的一抗（TNF-α，1∶1000；IL-6，1∶1000；ICAM-1，1∶1000；VCAM-1，1∶1000；p-P65，1∶1000；P65，1∶1000；p-AMPKα，1∶1000；AMPKα，1∶1000；GAPDH，1∶10000）在4℃过夜，TBST洗膜3次后用二抗（1∶5000稀释）在室温孵育1 h，TBST洗膜3次后用ECL化学发光法检测蛋白质条带，用GAPDH蛋白条带作为内参，以目的条带和内参条带的积分吸光值比值表示蛋白的相对表达水平。

1.5 分子对接技术预测AMPK和BZF的相互关系

从PDB蛋白质数据库下载AMPK与AMPK激动剂A769662的蛋白三维结构（PDB ID：4QFR）用于当前的对接研究。从ZINC数据库中获取配体BZF的三维结构（ZINC ID：3956919）的结构。利用Autodock tools工具去除AMPK三维结构中的溶剂水分子和配体，根据已知的AMPK激动剂A769662结构特性找到AMPKα激动剂与AMPKα的结合部位。将BZF与AMPK进行柔性对接，采用结合力评估结合能力的大小。在每一个对接后，移动小分子的位置，使之最匹配，采用Pymol 1.3软件进行3D作图。

1.6 统计学分析

实验结果数据以表示，采用SPSS16.0软件进行统计分析。One-way ANOVA用于多重比较，方差齐性采用LSD进行两两比较，方差不齐性采用DunnettsT3进行两两比较，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BZF对ox-LDL诱导HUVEC炎症因子mRNA和蛋白表达水平的影响

与细胞对照组相比，ox-LDL显著增加HUVEC细胞中TNF-α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1的表达（P＜0.01）（图1A-D）。与ox-LDL组相比，BZF 25，50和100 μmol·L-1显著抑制ox-LDL诱导的TNF-α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平升高，其量效关系呈负相关（r＝-0.978，P＜0.05；r＝-0.944，P＜0.05；r＝-0.929，P＜0.05；r＝-0.926，P＜0.05）。

Fig.1 Bezafibrate（BFZ）inhibited mRNA expression of tumor necrosis factor- α（TNF- α）（A），IL-6（B），intercel⁃lular adhesion molecule-1（ICAM-1）（C）and vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）（D）in oxidized low-density lipoprotein（ox-LDL）-induced human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）by quantitative PCR（qPCR）.HUVECs were incubated with ox-LDL 50 mg·L-1with or without BZF（25-100 μmol·L-1）for 24 h.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with ox-LDL group.

与细胞对照组比较，ox-LDL显著升高HUVEC细胞中TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和p-P65蛋白的表达（P＜0.01）（图2）。与 ox-LDL组相比，BZF 25，50和100 μmol·L-1显著抑制ox-LDL诱导的TNF-α表达升高（P＜0.01），其量效关系呈负相关（r＝-0.885，P＜0.05）；各浓度组的BZF显著抑制IL-6，其量效关系呈负相关（r＝-0.997，P＜0.05）；各浓度组的BZF显著抑制ICAM-1，其量效关系呈负相关（r＝-0.985，P＜0.05）；各浓度组的BZF显著抑制VCAM-1，其量效关系呈负相关（r＝-0.875，P＜0.05）；各浓度组的BZF显著抑制p-P65，其量效关系呈负相关（r=-0.997，P＜0.05）。

Fig.2 Effect of BFZ on protein expression levels of TNF- α（A，B），IL-6（A，C），ICAM-1（A，D），VCAM-1（A，E）and p-P65（A，F）in ox-LDL-induced HUVECs by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B-F were the semiquantitative results of A，respectively.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with ox-LDL group.

2.2 BFZ与AMPK相互作用的分子对接

分子对接模拟显示AMPK与BZF的结合力为-8.66 kcal·mol-1。AMPK与BFZ结合构象表面模拟模型，BZF位于AMPK结合口袋之中，BZF与AMPK的氨基酸残基LYS-51形成氢键连接，氢键的长度为2.3 Å，与氨基酸残基ILE-46，ARG-83，ASN-48，LYS-31，LEU-18，GLY-19，VAL-11，THR-106，ASP108和VAL-113通过范德华力连接（图3）。

2.3 BZF对AMPK α磷酸化水平的影响

与细胞对照组相比较，BZF25，50和100μmol·L-1能显著升高HUVEC中p-AMPKα的含量（均P＜0.01），其量效关系呈正相关（r＝0.994，P＜0.05）（图4）。

Fig.3 3D conformation of AMPK α-BFZ complex.ILE：isoleucine；ARG：arginine；ASN：asparagine；LYS：lysine；LEU：leucine；GLY：glycine；VAL：valine；THR：threonine；ASP：aspartic acid.

2.4 抑制AMPK α对BZF抗炎作用的影响

Fig.4 Effect of BZF on phosphorylation level of AMPK α by Western blotting.HUVECs were treated for 24 h.B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

Fig.5 Inhibition of AMPK α partly abolished inhibitory effect of BZF on mRNA expression levels of TNF- α（A），IL-6（B），ICAM-1（C）and VCAM-1（D）in ox-LDL-induced HUVECs by qPCR.HUVECs were separately treated with ox-LDL （50 mg·L-1），ox-LDL （50 mg·L-1）+BZF （100 μmol·L-1）and ox-LDL （50 mg·L-1）+BZF （100 μmol·L-1）+CC （5 μmol·L-1）for 24 h.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with ox-LDL group；##P＜0.01，compared with ox-LDL+BZF group.

BZF100 μmol·L-1显著抑制 ox-LDL 诱导的TNF-α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水平升高（P＜0.01）（图5）。AMPK抑制剂CC与BZF共孵育HUVEC后，BZF对TNF-α的抑制率由72.3%降低至44.4%（P＜0.01），对IL-6的抑制率由78.0%降低至29.8%（P＜0.01），对ICAM-1的抑制率由77.8%降低至55.0%（P＜0.01），对VCAM-1的抑制率由68.1%降低至40.6%（P＜0.01）。

3 讨论

本研究发现，BZF具有抑制ox-LDL诱导的炎症因子TNF-α，IL-6，ICAM-1和VCAM-1表达的作用，提示BZF可能通过抑制ox-LDL诱导的内皮炎症起到防治AS的作用。NF-κB是调控细胞炎症的关键转录因子，其P65亚基的磷酸化是NF-κB激活的标志［15］。Western蛋白印迹实验结果显示，BZF能显著抑制ox-LDL诱导的P65磷酸化水平的升高，提示BZF的抗炎作用与抑制NF-κB激活有关。

既往研究证实，AMPK具有抗炎作用，其激活后通过直接降低NF-κB活性进一步抑制炎症因子表达［16］。本研究采用分子对接技术预测AMPK与BZF是否能发生空间结合，发现AMPK与BZF的结合力是-8.66 kcal·mol-1，提示AMPK可能与BZF发生空间结合。因此，进一步采用Western蛋白印迹法检测BZF对AMPKα磷酸化的影响。结果显示，BZF能显著升高AMPKα Thy-172位点的磷酸化水平。Thy-172位点的磷酸化是AMPK激活的标志。本研究表明，BZF可能是潜在的AMPK激动剂。目前研发出的AMPK小分子激动剂类药物，由于生物利用度低、非特异性作用等原因未能进入临床，如A-769662等［17］。因此，从上市药物中探索具有AMPK激动剂作用并用于防治AS及相关心血管疾病的有效药物，具有重要的临床意义。BZF是已上市药物，有较好的成药性，本研究结果为临床运用BZF激活AMPK提供了实验证据。

上述结果表明，BZF具有激活内皮细胞AMPK的作用。既往研究表明，BZF是核受体超家族成员PPAR受体的激动剂，PPAR被激活后可抑制多种炎症因子的表达［18］。为进一步探索激活AMPK在BZF抗炎中的作用，本研究采用AMPKα抑制剂CC特异性抑制AMPKα活性后，观察BZF的抗炎作用。当AMPKα活性被抑制后，BZF的对炎症因子及黏附分子表达的抑制作用显著降低。由此提示，AMPKα的激活在增强BZF抑制ox-LDL诱导HUVEC炎症反应中具有重要作用。

综上所述，BZF能抑制ox-LDL诱导的HUVEC炎症反应，BZF可能是一个潜在的AMPKα激动剂，其抗炎作用与AMPKα激活密切相关，提示激活AMPKα可能是BZF类药物防治AS以及其他心血管疾病的新靶点。