素花虎头兰×黄蝉兰F1代原球茎再生体系的建立

刘 丹， 徐铭洋， 叶长宁， 李灵丽， 朱瑞玲， 李枝林， 王玉英

(1.云南农业大学园林园艺学院，云南昆明 650201； 2.商丘职业技术学院实训中心，河南商丘 476000)

素花虎头兰(黄色素花)(Cymbidiumtracyanumvarhuanghua)为兰科兰属植物，附生于山崖或树枝上，秋末冬初开花，花为黄绿色素花，花淡香。黄蝉兰(C.iridioidesD. Don)亦为兰科兰属多年生常绿草本植物，花大，黄色带褐色条纹，花期4—6月；黄蝉兰产于西藏南部和东南部，多生于海拔高度为1 300～2 400 m的林缘草丛岩石上[1]。中国兰作为中国的传统名花，因其株形幽雅、花姿优美、幽香四溢，自古以来深受人们的喜爱[2]，适宜作切花或大型盆栽，具有颇高的观赏价值。利用传统杂交育种技术，获得莲瓣兰金黄素×墨兰白墨F1代植株，以期选育出具有二者优势的兰花新品系。兰花生长周期长、繁殖系数低，在育种过程造成了不同程度的阻力。随着人们对兰属花卉优良性状需求的日益提高，培育新型兰属花卉新品种已成为满足市场需要的关键。

高频再生体系是转基因工程成功的关键，构建优良基因转化受体系统，要求植物材料有高效稳定的再生能力和大量稳定的外植体来源[3]。研究表明，兰花转基因研究胚性愈伤组织、悬浮细胞和原生质体是较理想的受体系统，但因材料难以获得，生长缓慢，继代培养或再生困难，而不适宜广泛应用[4-5]。单子叶植物一般难以从叶片诱导愈伤组织或体胚。在兰科植物中，原球茎(protocorm-like body，PLB)被认为起源于单细胞，相当于双子叶植物体胚。《植物生物学词典》(1994年)中将之定义为植株基部由1团尚未分化的薄壁细胞组成的上端有顶端生长点和叶原基，下端有很多不定根、初具球茎形态的球状体，是兰科植物的一种再生方式。目前大量研究表明，通过诱导PLBs可以获得更高的植株诱导率和繁殖系数[6-17]；此外相比兰科其他种，铁皮石斛的基因序列已注释[18-19]，石斛的遗传转化体系较为成熟[20]，石斛已成为兰科家族理想的遗传操作模式植物[21]。

然而，目前素花虎头兰×黄蝉兰F1代原球茎受体系统的研究尚未见报道。因此，本试验通过不同激素配比研究最适宜素花虎头兰×黄蝉兰F1代原球茎受体系统，以期获得最佳再生体系的培养基材料和配方，为素花虎头兰×黄蝉兰F1代植株产业化生产和转基因工程研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄色素花虎头兰与黄蝉兰杂交F1植株组培苗(TRIR-1)[22]，由云南农业大学园林园艺学院花卉研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 以TRIR-1原球茎为材料的原球茎诱导增殖培养 选择6-BA、NAA和KT作为外源激素，采用3因素随机区组试验设计，在1/2MS培养基中，添加不同浓度激素的NAA、6-BA和KT，附加80 g/L香蕉汁、0.5 g/L活性炭和1.5 g/L花宝1号，培养40 d观察原球茎生长状态并统计原球茎增殖倍数和分化率，筛选出最佳浓度。

1.2.2 以TRIR-1茎尖为材料的原球茎诱导增殖培养 采用3因素随机区组试验设计，分别设置植物激素浓度，即NAA(0.1、0.5 mg/L)、6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和KT(0、0.1、0.5 mg/L)，以1/2MS为基本培养基，附加80 g/L香蕉汁、0.5 g/L 活性炭、1.5 g/L花宝1号。培养40 d后观察原球茎生长状态并统计增殖倍数和分化率，筛选出最佳浓度。

1.2.3 以TRIR-1叶片基部为材料的原球茎诱导增殖培养 以6-BA、NAA和KT作为外源激素，采用3因素随机区组试验设计，培养于1/2MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+80 g/L香蕉汁+0.5 g/L活性炭+1.5 g/L花宝一号培养基中，附加不同浓度的激素，pH值为5.8，培养40 d后观察原球茎生长状态并统计原球茎增殖倍数和分化率，筛选出最佳浓度。

1.2.4 生根培养 以株高为2～5 cm的无根苗TRIR-1为材料，采用单因素完全随机区组试验设计，设置NAA浓度梯度为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，6-BA浓度为 0.3 mg/L，以 1/2MS 为基本培养基，附加80 g/L香蕉汁、0.5 g/L 活性炭、1.5 g/L 花宝1号，定期观察生根情况，90 d后统计数据。

1.2.5 培养条件 以原球茎为材料，进行原球茎诱导增殖培养时先暗培养4周，再转入光照培养；以茎尖和无菌苗叶片基部为材料时先进行光照培养，10 d后没有原球茎长出，再转入暗培养(2周)，再转入光照培养。光照度为1 000～1 800 lx，光照时间为12～14 h/d；温度为22～26 ℃；pH值为5.8。

1.3 数据分析

不同材料诱导增殖培养原球茎阶段试验时分别设置7个处理，每处理7瓶，每瓶接种5个材料。生根培养阶段试验共设置5个处理组，每个处理组9瓶，每瓶接种4株无根苗。

统计数据用DPS软件分析数据，Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 以TRIR-1原球茎为材料，不同激素配比对TRIR-1原球茎诱导增殖的影响

研究发现，不同激素配比对TRIR-1原球茎诱导增殖的效果差异显著(表1)。处理2即1.0 mg/L 6-BA和 0.5 mg/L NAA激素配比对原球茎诱导增殖的效果最佳，增殖倍数为4.50，显著高于对照、处理7、处理4、处理3、处理6、处理5，分别高31.58%、36.36%、38.89%、80.00%、85.95%、103.62%(P<0.05)，原球茎呈绿色细小且紧实的颗粒状，长势最好，褐变率低，部分分化成小苗。当6-BA和NAA组合浓度分别为1.0、0.5 mg/L和2.0、0.1 mg/L时，随着KT浓度增加，原球茎增殖倍数呈递减的变化，这说明低浓度KT有利于原球茎的生长。当NAA浓度为 0.5 mg/L，不添加KT时，原球茎的增殖倍数随6-BA浓度增加而降低，当NAA浓度减小至0.1 mg/L和KT浓度增加至0.1 mg/L时，原球茎的增殖倍数随着6-BA浓度的增加而增加，这说明3种激素互相影响。因此，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥是原球茎增殖培养的最佳配方(图1-A)。当6-BA、NAA、KT分别为2.0、0.1、0.1 mg/L时，原球茎的分化率极显著高于其他处理，分化率达到38.80%。因此，最佳分化培养基为 1/2M+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥。

2.2 以TRIR-1丛生芽为材料，不同激素配比对TRIR-1原球茎诱导增殖的影响

研究发现，不同激素配比对TRIR-1原球茎诱导增殖的效果差异显著(表2)。处理2即1.0 mg/L 6-BA和 0.5 mg/L NAA激素配比诱导增殖的效果最佳，增殖倍数为1.68，显著高于对照、处理5、处理7、处理3、处理4，分别高80.65%、82.61%、133.33%、236.00%、546.15%(P<0.05)，原球茎浅绿色，轻度褐化，生长状态最佳。因此，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥是原球茎增殖培养的最佳配方(图1-B)。当6-BA、NAA分别为1.5、0.5 mg/L时，原球茎的分化率极显著高于其他处理组合，达到84.32%。因此，最佳分化培养基为1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥。

2.3 以TRIR-1无根苗为材料，不同激素配比对TRIR-1原球茎诱导增殖的影响

研究发现，不同激素配比对TRIR-1原球茎诱导增殖的效果差异显著(表3)。处理3即1.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA和0.5 mg/L KT激素配比对原球茎诱导增殖的效果最佳，增殖倍数为0.33，显著高于处理6、处理5、处理4、对照、处理2、处理7，分别高57.14%、175.00%、371.43%、450.00%、450.00%、∞(P<0.05)， 原球茎为绿色颗粒状，轻度褐化，长势一般。因此， 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L

表1 不同激素配比对TRIR-1植株原球茎诱导、增殖和分化的影响

注：褐化程度(x)指原球茎发生褐化的比例，+、++、+++分别表示5%≤x≤15%、15%≤x≤30%、x≥30%。同列数据后不同小写、大写字母表示处理间分别在0.05、0.01水平存在显著差异；下同。

表2 不同激素配比对TRIR-1植株原球茎诱导、增殖和分化的影响

表3 不同激素配比对TRIR-1植株原球茎诱导、增殖和分化的影响

NAA+0.5 mg/L KT+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥是原球茎增殖培养的最佳配方(图1-C)。当6-BA和NAA浓度分别为1.0、0.5 mg/L 时，原球茎的分化率极显著高于其他处理，达到100%，处理7没有诱导出原球茎，故生长状况未进行统计。因此，最佳分化培养基为 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L 花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥。

2.4 不同处理对TRIR-1生根效果的影响

研究发现，不同处理对TRIR-1无根苗生根的效果差异显著(表4)。5个处理对TRIR-1的生根率均达到100%，处理4的TRIR-1的平均根数最多，达4.69条，显著高于处理5、处理3、处理2、对照，分别高23.10%、32.86%、97.89%、115.14%(P<0.05)；处理4的TRIR-1的平均根长最长，达7.31 cm，显著高于处理5、处理3、处理2、对照，分别高 10.26%、23.06%、31.95%、80.49%(P<0.05)，根毛多，粗壮，生长状态最佳。因此，1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥是组培苗的最佳生根培养基(图1-D)。

表4 不同处理对TRIR-1生根的影响

3 讨论与结论

兰花大量扩繁的有利阶段是原球茎的增殖期，此时期是提高繁殖系数的核心[23]。原球茎具有繁殖效率高、易于生根等优点，是兰科植物重要的繁殖方式之一[24]。原球茎的诱导增殖受植物材料的种类、外源激素的种类与浓度的影响。本试验结果表明，以TRIR-1原球茎为材料，原球茎诱导增殖倍数显著高于以TRIR-1茎尖和叶片基部为材料的原球茎增殖倍数，诱导增殖培养40 d后，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥的增殖效果最好，原球茎浓绿，生长最快，增殖倍数达4.50，略高于杨玉珍等在大花蕙兰原球茎诱导增殖的报道[25]，但低于季华等的报道[26]，这可能与兰花种类不同有关，具体原因还须进一步研究。

TRIR-1原球茎为材料诱导增殖原球茎中，当6-BA和NAA组合浓度分别为1.0、0.5 mg/L和2.0、0.1 mg/L时，随着KT浓度的增加，原球茎增殖倍数呈递减的变化，低浓度的KT对原球茎增殖有明显的促进作用，这与杨玉珍等的报道[25，27-28]一致；当NAA浓度为 0.5 mg/L、6-BA浓度在1.0～1.5 mg/L范围内，原球茎的增殖倍数随着6-BA浓度的增加而降低，这与韩劲峰等的研究结果[29]一致，但与付志惠等的报道[30-31]不同；本研究发现1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L炭粉+80 g/L香蕉泥的分化率最高，达38.8%，低于常美花等在大花蕙兰原球茎分化的报道[32]，谷祝平等报道较高浓度的BA能促进大花蕙兰原球茎的增殖，较低浓度BA促进原球茎分化[33]。因此，本研究分化率的偏低可能与激素浓度有关，具体原因尚待进一步研究。

王亚沉等对不同NAA浓度对碧玉兰生根的影响做了研究，发现生根率均达100%，平均根长为4.6 cm[34]；张晨晨等研究发现，生根率均达100%，最长根长为3.94 cm[35]。本研究最适生根培养基配方为1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+1.5 g/L花宝1号+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥，生根率达到100%，根的数量最多，平均株根数为 4.69 条，平均根长为7.31 cm，根粗壮且根毛多，植株生长健壮，叶片浓绿，这与王亚沉等的报道[34]一致，与张晨晨等的报道[35]略有不同。本研究中以TRIR-1茎尖和叶片基部为材料诱导增殖原球茎效果较差，最高增殖倍数分别仅为1.68和0.33，与前人相关报道结果[36-41]不同。