熟地黄对帕金森病异动症模型大鼠纹状体内NMDA-R1、NMDA-R2和GABA-RB1表达的动态变化研究*

滕 龙 洪 芳 何建成#

1 浙江医院 浙江 杭州310013 2 上海中医药大学 上海 201203

帕金森病（PD）是一种神经变性疾病，由于黑质-多巴胺（DA）能神经元变性、坏死，导致黑质-多巴胺能神经元受损，引起直接通路-间接通路失调是其主要发病机制。本实验基于前期研究，通过检测大鼠脑内γ-氨基丁酸（GABA）受体和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体相关基因表达的变化，探索熟地黄治疗PD及左旋多巴诱导异动症（LID）的“增效减毒”机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及条件：SPF级SD大鼠，雄性，120只，体重180～200g，由上海中医药大学实验动物中心提供[SCXK（沪）2012-0002]。动物饲养在上海中医药大学实验动物中心，恒温23±2℃，相对湿度60%～65%，动物摄食、饮水及活动自由。无菌手术在上海中医药大学实验动物中心进行[SYXK（沪）2014-0008]，并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 实验主要试剂、药物及仪器：Trizol Reagent（Invitrogen公司）；Reverse Transcription System（Promega公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma公司）；GoT-aq® qPCR Master Mix（Promega公司）；氯仿（上海试一化学试剂有限公司）；引物合成（上海生工）；荧光定量PCR仪：ABI 7500型；RNA/DNA calculator（Pharmacia公司）；高速冷冻离心机（BECKMAN公司）；6-hydroxydopamine（6-OHDA）、阿扑吗啡（APO）、抗坏血酸、左旋多巴干粉、苄丝肼，均为美国Sigma公司产品；大鼠脑立体定位仪：TOW-3A型。熟地黄浓度为5.18g/ml，由上海雷允上药材有限公司代加工。大鼠中药的每日用量按孙瑞元[1]方法计算。

1.3 LID大鼠模型制备：采用Ungerstedt等[2]创立的方法。术前按常规进行行为测试，确认无异常旋转行为后，用3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，头部去毛，苯扎溴铵常规消毒。无菌条件下，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。以前囟为准，据包新民等[3]著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质二坐标：①前囟后5.2mm，正中线右侧1.0mm，硬膜下9.0mm。②前囟后5.2mm，正中线右侧2.5mm，硬膜下8.5mm。用颅骨钻于手术要求部位小心钻开颅骨，用5μl微量进样器将6-OHDA（溶于含0.2%维生素C的生理盐水中，即称量药品抗坏血酸0.001g，溶于生理盐水0.5ml中）注入右侧黑质部（以1.0mm/min速度缓慢进针），每孔3μl，注射速度1μl/min，注射完后留针5min，然后以1.0mm/min速度缓慢退针。手术完成后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素7d，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。假手术组也按上述方法操作，但只注射0.2%维生素C的生理盐水，正常对照组只捆绑动物，不作任何处理。10d后，以腹腔注射APO 0.5mg/kg诱发大鼠向一侧旋转，记录开始旋转至30min内的旋转圈数，以旋转圈数平均＞7次/min者为合格PD模型[4]。将成功PD模型大鼠予腹腔注射左旋多巴+苄丝肼（50mg/kg左旋多巴和12.5mg/kg苄丝肼），每日2次，连续2周。正常对照组、假手术组予腹腔注射等量的含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水，每日2次，连续2周。2周后,诱发动物具有典型不自主动作（AIM）表现（AIM评分＞20），且APO诱导大鼠对侧旋转圈数增加者，为成功LID模型大鼠[4]。

1.4 分组及给药：采用区层随机法，将成功的LID模型大鼠分为4组，LID 4周、6周模型组及熟地黄4周、6周组，每组各8只。另取正常对照4周、6周组、假手术4周、6周组，每组各8只。LID模型组大鼠在腹腔注射左旋多巴+苄丝肼（50mg/kg左旋多巴和12.5mg/ml苄丝肼）基础上予生理盐水灌胃；熟地黄组大鼠在腹腔注射左旋多巴+苄丝肼基础上予中药熟地黄汤灌胃；正常对照组、假手术组予腹腔注射等量含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水基础上给予生理盐水灌胃。每次灌胃量为2ml，每日1次，分别连续用药4周、6周。

1.5 统计学方法：所有资料均用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS16.0软件进行齐性检验并做t检验和方差分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LID模型大鼠纹状体内GABA-RB1基因表达的动态变化及熟地黄干预作用：见表1。

表1 LID模型大鼠纹状体内GABA-RB1基因表达的动态变化及熟地黄干预作用（±s）

表1 LID模型大鼠纹状体内GABA-RB1基因表达的动态变化及熟地黄干预作用（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.001；与假手术组比较，#P＜0.001；与LID模型组比较，&P＜0.001。

正常对照组假手术组LID模型组熟地黄组8 8 8 8 1.065±0.086 0.851±0.150 0.204±0.009*#0.414±0.023*#&0.845±0.138 0.684±0.127 0.131±0.015*#0.422±0.025*#&

2.2 LID模型大鼠纹状体内NMDA-R1和NMDA-R2基因表达的动态变化及熟地黄干预作用：见表2。

表2 LID模型大鼠纹状体内NMDA-R1和NMDA-R2基因表达的动态变化及熟地黄干预作用（±s）

表2 LID模型大鼠纹状体内NMDA-R1和NMDA-R2基因表达的动态变化及熟地黄干预作用（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与LID模型组比较，&P＜0.001；与4周组比较，△P＜0.01，△△P＜0.001。

正常对照组假手术组LID模型组熟地黄组8 8 8 8 0.030±0.006 0.030±0.003 0.112±0.009***###0.058±0.004***###&0.031±0.003 0.030±0.002 0.167±0.012***###△△0.061±0.004***###&0.915±0.105 0.827±0.092 2.146±0.302***###1.111±0.132*#&0.928±0.168 0.992±0.103 2.430±0.183***###△1.252±0.258**##&

3 讨论

根据临床症状，PD属中医学“颤证”范畴，前期我们通过梳理与挖掘文献，总结出PD是以肝肾阴亏,脏腑功能失调为本，风、痰、瘀、毒互结蕴塞脑窍为标的本虚标实之证[5]。由此确立治疗大法以滋补肝肾为主。我们将滋补肝肾、养血益精的熟地黄作为治疗用药。如《景岳全书》曰：“阴虚而神散者，非熟地之守，不足以聚之；阴虚而躁动者，非熟地之静，不足以镇之；阴虚而刚妄者，非熟地之甘，不足以缓之。”

广泛存在于脑内的氨基酸类神经递质，按其对突触后神经元的不同作用，可分为兴奋性氨基酸（EAA）和抑制性氨基酸（IAA）。NMDA受体是存在于中枢神经系统内的一类重要的EAA受体，到目前为止已克隆出5个亚基：NMDA-R1、NMDA-R2（A-D）。实验发现，大鼠脑内的NMDAR1和NMDA-R2基因表达，LID模型组与正常对照组、假手术组相比有显著上调趋势，LID 6周组与LID 4周组相比也有上调趋势，说明大量EAA受体（主要是NMDA受体）过度激活后，可能会引起神经元凋亡。左旋多巴的长期应用可能与兴奋性毒性的过度堆积有关。熟地黄干预后，NMDA-R1、NMDA-R2基因表达较LID模型组相比较呈降低趋势，说明熟地黄可以显著改善兴奋性氨基酸蓄积产生的兴奋性毒性，缓解帕金森病异动症的症状。γ-氨

基丁酸（GABA）是主要的抑制性氨基酸（IAA）。有研究表明，纹状体内的GABA对调节基底神经节-丘脑-皮层环路的兴奋-抑制平衡发挥重要的作用。实验发现，LID模型与正常对照组、假手术组相比，大鼠脑内GABA-RB1基因表达有显著下调趋势；LID 6周组与LID 4周组相比，大鼠脑内GABA-RB1基因表达也有下调趋势。熟地黄干预后，GABA-RB1基因表达较LID模型组相比，呈升高趋势，说明熟地黄可能通过升高抑制性氨基酸相关基因的表达而缓解LID的症状。