猪源沙门氏菌多药外排泵oqxAB和氟苯尼考耐药基因floR的检测分析

李 帆,罗行炜,刘建华,梁 军,贺丹丹,潘玉善,苑 丽,胡功政*

(1.河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州 450002;2.河南省郑州市兽药饲料监察所,河南 郑州 450000)

0 引言

沙门氏菌是一种人兽共患病原菌,分布广,危害大,该菌也是世界各地人类食物中毒的主要致病菌,因此,沙门氏菌的多重耐药性对动物与人类健康构成了严重威胁。细菌耐药性可通过外排泵等多种耐药机制产生[1]。2003年,1个新的耐药结节分化(RND)家族多药外排泵oqxAB由丹麦科学家Sorensen等[2]在大肠杆菌接合性质粒pOLA52上发现,是首先发现的对喹乙醇耐药的分子机制[3],现已被确定为质粒介导的喹诺酮类的耐药机制(PMQR)之一[4]。oqxAB由基因oqxA和oqxB组成,不仅介导对喹噁啉类药物(喹乙醇、痢菌净)、氯霉素的耐药性,而且还可降低细菌对氟苯尼考、喹诺酮类(环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星)、TMP和替加环素等药物的敏感性[5-7]。Kim等[8]首次从鱼的巴氏杆菌多重耐药R质粒中发现了耐氟苯尼考的基因,并将其定名为pp2flo。随后又相继从沙门氏菌、大肠杆菌和葡萄球菌属中克隆到氟苯尼考耐药基因floR、cfr和fexA。后来鸡源、牛源和猪源大肠杆菌中的floR基因也相继被报道。现已证实floR基因同时对氯霉素和氟苯尼考耐药。故对编码多药外排泵的oqxAB以及floR基因进行检测分析,对兽医临床治疗及公共卫生菌研究有重要意义。

近年来,oqxAB在肠杆菌科细菌中的检测分析较多,主要集中在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌[7-11],而在沙门菌中的研究报道较少[12]。本文测定了分离的猪源沙门菌对外排泵oqxAB代表性相关药物的敏感性,用PCR及测序方法检测了oqxAB,并分析了分离菌中oqxAB基因的分布流行特点,旨在为有效控制沙门氏菌感染提供理论依据;此外,对试验菌株用ERIC-PCR方法进行了基因分型,了解oqxAB基因阳性菌之间的克隆关系,以期为进一步研究oqxAB基因的传播扩散机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 215株已鉴定的猪源沙门氏菌于2016～2018年采集于全国7个不同的省份(陕西、山西、湖北、河南等地)。质控菌大肠埃希菌ATCC25922由中国普通微生物菌种保管中心提供。

1.1.2 药物及培养基 试验药物:喹乙醇(OQX,95.5%,江苏天成动物保健品公司)、痢菌净(MEQ,99.1%,南通市合成兽药厂)、氟苯尼考(FFC,99.5%, Amresco公司)、恩诺沙星(ENR,99.8%,北京万佳首化生物科技有限公司)。培养基: SS琼脂、LB肉汤、MHB肉汤。

1.1.3 分子生物试剂 琼脂糖、DNA Marker、Premix Ex Taq等购自北京康为世纪有限公司;50×TAE购自北京索莱宝有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 数显水浴恒温振荡器(金坛华峰仪器有限公司)、PCR扩增仪(美国ABI公司)、超净工作台(苏静集团苏州安泰空气技术有限公司)、GENE GENIUS全自动凝胶图像分析系统(英国Syngene公司)、电泳仪(北京市六一仪器厂)、细菌比浊仪(法国Biomerieux)、AB204-N型电子分析天平(梅特勒-托里仪器上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用微量肉汤稀释法,分别测定喹乙醇、痢菌净、氟苯尼考和恩诺沙星对分离菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concertration, MIC),按照美国临床试验室标准化协会(CLSI)的标准[17]及Hansen等[3]的研究结果判读试验结果并计算MIC50和MIC90。

1.2.2 基因检测

1.2.2.1 提取基因组 从纯化的SS琼脂平板上挑取单个菌落接种于LB肉汤中,置于水浴恒温振荡器中震荡12 h；然后吸取1 mL到1.5 mL EP管中,以12000 r/min离心5 min；弃去上清液,加入200 μL TE缓冲液,吹打至完全浑浊,在沸水中煮10～15 min,以12000 r/min离心3 min,保留上清液。

1.2.2.2 基因的PCR及测序 通过PCR扩增oqxA、oqxB和floR基因,扩增用引物参照文献[17-18]进行设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以基因DNA为模板进行PCR反应。20 μL反应体系:10 μL Premix Ex Taq酶,上、下游引物、模板DNA各1 μL, ddH2O 1 μL,设1对空白对照。反应参数:94 ℃预热5 min,94 ℃变性4 min,退火(根据不同的引物设置不同的温度)45 s,72 ℃延伸(30 s/500 bp),循环30～35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%(ERIC PCR产物需1.8%)琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，在紫外投射仪下观察结果并用凝胶成像系统摄像,如果出现与阳性对照在同一位置的条带即为阳性,说明该菌株携带有此种耐药基因。将代表性PCR产物送上海生工生物工程公司测序,测序结果经“http://blat.ncbi.nlm.nih.gov/Blast”网上比对确认。

1.2.3 ERIC-PCR分型 提取oqxA或oqxB基因检测呈阳性的猪沙门氏菌基因组为模板,利用ERIC-2[19]引物5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′对其进行PCR扩增,利用NTSYSpc 2.1软件对电泳条带进行分析,凡相似度大于75%者为同一型,代表同一克隆株。

2 结果与分析

2.1 药敏试验结果

猪沙门氏菌耐药表型和MIC分布范围见表1。由表1可知：215株分离菌中对喹乙醇、痢菌净、氟苯尼考和恩诺沙星耐药的分别有70、45、199和36株,耐药率分别为32.56%、20.93%、92.56%、16.74%;对喹乙醇和痢菌净均耐药的有24株；喹乙醇、痢菌净、氟苯尼考和恩诺沙星对猪沙门氏菌的MIC50分别为32、32、128、1 μg/mL, MIC90分别为128、64、512、8 μg/mL。

表1 4种药物对215株猪源沙门氏菌的MIC值分布

2.2 oqxA和oqxB检测结果

在215株猪源沙门氏菌中分别有152、159株菌携带oqxA和oqxB,携带率分别为70.70%和73.95%。有152株菌同时携带oqxA和oqxB,共同携带率为70.70%，即并未发现单独携带oqxA的菌株。有56株菌不含任何1个oqxA或oqxB。猪沙门氏菌oqxAB基因以及floR基因扩增产物的电泳结果分别见图1和图2。携带oqxA或oqxB的猪源沙门氏菌对喹乙醇、痢菌净的敏感性表型测定结果见表2。

2:携带oqxA的菌株样品;4:携带oqxB的菌株样品;

6:阴性对照;7:携带floR基因的菌株样品;8:阳性对照。

药物抗性菌株数(抗性率)oqxA携带率/%oqxB携带率/%喹乙醇70(70/215)82.86(58/70)84.29(59/70)痢菌净145(145/215)64.83(94/145)68.97(100/145)

2.3 ERIC分型结果

对含有oqxA或oqxB的159株猪源沙门氏菌进行ERIC-PCR扩增,按相似度大于75%者为同一型,可分A～Q共17个型,每个型分别含有47、39、1、23、2、23、2、1、2、2、3、2、1、2、3、5、1株菌,oqxA或oqxB在各个型中均存在(图3),说明含有oqxA或oqxB基因的菌株既来源于不同的克隆,也有部分菌株来自同一克隆。

3 讨论

沙门氏菌是最常见的人畜共患病原菌之一,具有较强的致病性,对外界环境的抵抗力较强。目前,无论是人类临床治疗,还是农业及畜牧业的生产中,抗生素仍然是对付各种病原菌的首要选择。由于抗菌药物的不规范使用,尤其滥用现象严重,导致耐药菌株逐年增长,细菌耐药问题变得愈加突出。本试验发现：215株猪源沙门氏菌对喹乙醇的耐药率为32.56%,低于王敖雪等[14]报道的肉鸡沙门氏菌对喹乙醇的耐药率(100%)，也低于狄文婷等[15]描述的猪源沙门氏菌对喹乙醇的耐药率58.3%；本试验猪源沙门氏菌对氟苯尼考的耐药率为92.56%，明显高于黄凯等[16]报道的对氟苯尼考的耐药率(66.67%);对恩诺沙星的耐药率为16.74%,明显低于刘艳红等[17]报道的猪源沙门氏菌和大肠杆菌对恩诺沙星的耐药率(66.7%)。这种耐药率的差异,可能与养猪场的地理位置、所处环境不同,抗生素的使用方法和剂量有关。本试验还发现,有11.16%的菌株对喹乙醇和痢菌净同时耐药,说明猪源沙门氏菌对喹噁啉类药物存在一定的交叉耐药性。

从表1和表2可以看出,猪源沙门氏菌中oqxA和oqxB的携带率分别为70.70%和73.95%,同时携带oqxA、oqxB的菌株所占比例为70.70%,说明oqxAB已有较高的流行率。宫艳彬等[18]报道的死亡鸭胚沙门菌中oqxA和oqxB的携带率分别为9.46%和2.70%,远低于本试验所报道的数据。江萍等[19]报道的新疆地区猪源沙门氏菌中oqxA和oqxB的携带率分别为64.7%和65.5%,这与本试验数据基本相近。由此可以看出,因地理位置不同,菌株来源及宿主不同,分离菌中oqxA和oqxB的携带率存在较大的差异。本试验菌株采集自全国7个省份,较为广泛,具有一定的代表性。oqxA和oqxB位于同一操纵子上,本试验中oqxA的检出率低于oqxB的检出率,可能是由于oqxA引物的结合位点存在突变而使部分菌株的oqxA无法检出。此外,在215株猪源沙门氏菌中分别有152和159株菌携带oqxA和oqxB,但是分别只有70和45株菌对喹乙醇和痢菌净耐药。在本试验中，猪源沙门氏菌菌株对oqxA和oqxB的携带率(分别为70.70%和73.95%)远远高于对喹乙醇和痢菌净的耐药率(分别为32.56%和20.93%),表明部分oqxA或oqxB基因并未表达。同时,在对喹乙醇耐药的菌株中，oqxA和oqxB的检出率分别为82.86%和84.29%,高于对喹乙醇不耐药的菌株中oqxA和oqxB的检出率(分别为64.83%和68.97%)。说明oqxA和oqxB是导致细菌对喹乙醇耐药的主要机制。而对氟苯尼考的耐药率为92.56%,明显高于floR的检出率72.56%,这可能是由于新的耐药基因或本试验中未检测的其他有关耐药基因的存在,同时还有可能是oqxA、oqxB的存在致使氟苯尼考的耐药性增强。

图3 含有oqxA或oqxB基因的菌株ERIC分型图

由图3的ERIC-PCR结果可以看出,含有oqxA或oqxB的159株猪源沙门氏菌可分为A～Q共17个ERIC型,各个型分别含有47、39、1、23、2、23、2、1、2、2、3、2、1、2、3、5、1株菌,由此可见含有oqxA或oqxB的猪源沙门氏菌分离株多数来自不同的克隆株,oqxA和oqxB广泛存在于不同的克隆菌株中。