裸花紫珠提取物对银屑病作用及机制研究

巴立娜

[摘要] 目的 探讨裸花紫珠提取物抗银屑病作用。 方法 60只KM小鼠按照随机数字表法分为模型组、裸花紫珠提取物低剂量组、裸花紫珠提取物中剂量组、裸花紫珠提取物高剂量组和阳性药对照组，每组各12只。分别灌胃给予生理盐水，0.6、1.2、2.4 g/kg裸花紫珠提取物，1 mg/kg甲氨蝶呤，连续7 d。HE法检测完整颗粒层鳞片数；Western blot技术检测Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2蛋白表达；Real-time PCR技术检测Caspase3、Bax、BCL-2基因mRNA表达。 结果 裸花紫珠中、高剂量组鼠尾完整颗粒层鳞片数明显高于模型组（P < 0.05）；裸花紫珠中、高剂量组促凋亡蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax蛋白和mRNA表达均高于模型组（P < 0.05），抗凋亡蛋白BCL-2蛋白和mRNA表达下调（P < 0.05）。 结论 裸花紫珠提取物通过诱导凋亡发挥抗银屑病作用。

[关键词] 裸花紫珠；银屑病；颗粒层；凋亡

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（c）-0014-05

Study of effect and potential mechanism of Callicarpa nudiflora extract against psoriasis

BA Li′na

Basic Medical College， Harbin Medical University （Daqing）， Heilongjiang Province， Daqing 163319， China

[Abstract] Objective To determine the anti-psoriasis effect of Callicarpa nudiflora extract. Methods Sixty KM mouses were randomly divided into 5 groups by random number table （n = 12）， including model group， Callicarpa nudiflora low-dose group， Callicarpa nudiflora middle-dose group， Callicarpa nudiflora high-dose group and positive control group. They were given to normal saline， Callicarpa nudiflora extract （0.6 g/kg or 1.2 g/kg or 2.4 g/kg） and 1 mg/kg methotrexate by gastric perfusion for seven days respectively. Lateral line scales of granular layer were detected by HE method. The expression of Caspase3， Cleaved-Caspase3， Bax and BCL-2 mRNA and protein were detected by Real-time PCR and Western blot. Results Lateral line scales of granular layer of Callicarpa nudiflora middle-dose and high-dose groups was increased than those in the model group （P < 0.05）. The expression of the pro-apoptotic proteins Caspase3， Cleaved-Caspase3， Bax mRNA and protein in callicarpa nudiflora middle-dose and high-dose groups were up-regulated than those in the model group （P < 0.05）， the expression of the anti-apoptotic protein BCL-2 mRNA and protein was down-regulated （P < 0.05）. Conclusion The Callicarpa nudiflora extract can exert anti-psoriatic effect by inducing apoptosis.

[Key words] Callicarpa nudiflora； Psoriasis； Granular layer； Apoptotic

銀屑病俗称为牛皮癣，是一种红斑鳞屑炎症自身免疫皮肤病[1]，其发病率高、发病原因多样、病程较长、对病人的身心具有严重影响，但是发病机制尚不明确[2-5]。发病特征主要包括表皮细胞的过度增殖、分化异常、以及凋亡减少[6]。细胞凋亡也称为细胞程序性死亡，是一种基因调控的细胞主动性的“自杀”过程。这个过程被促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同调控[7]。Caspase3可以加速与细胞结构、细胞周期等相关的蛋白或激酶失活，导致细胞发生凋亡[8]。Caspase3活化标志凋亡进入不可逆阶段[9]。BCL-2蛋白家族是调控Caspase蛋白激活的一类重要的细胞因子。BCL-2主要分为抗凋亡和促凋亡两个亚族，其中抗凋亡亚族主要有BCL-2等，促凋亡亚族主要包括Bax等[10]。中药裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook）传统的药理作用包括抗炎、解毒、收敛、止血等[11-12]。在临床上，裸花紫珠也被用于皮肤病的治疗，但其抗银屑病的作用并未见报道。本研究拟探讨裸花紫珠提取物对小鼠鼠尾银屑病模型的作用及其机制是否与促进细胞凋亡有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级KM小鼠，体重18～22 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证号：SCXK（京）2012-0001。将60只小鼠经适应性喂养7 d后（饲养室温度20～25℃，相对湿度50%～65%）。

1.2 实验材料

1.2.1实验试剂

甲氨蝶呤片（MTX，上海信谊药厂有限公司），Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2抗体（Cell Signaling公司，美国），Caspase3、BCL-2、Bax mRNA引物（Pall Life Science公司，美国），RNA逆转录试剂盒（Invitrogen，USA），SYBR Green PCR Master Mix（Invitrogen，USA）。

1.2.2裸花紫珠提取物

裸花紫珠药材（产地为海南，经中国科学院华南植物园华南植物鉴定中心叶华谷研究员鉴定为裸花紫珠Callicarpa nudiflora，标本现存于中国科学院华南植物园标本馆）。裸花紫珠提取物制备方法：裸花紫珠干燥叶4 kg经80%乙醇加热回流提取3次，提取液经过滤，合并滤液，减压蒸馏至膏状，冷冻干燥，得到干粉。

1.3 实验方法

1.3.1银屑病动物模型

1.3.1.1小鼠鼠尾银屑病模型 正常小鼠尾部，鳞状上皮缺乏颗粒层，角质层内有残留细胞核，为自然角化异常，类似于银屑病角化不全的病理生理改变，故无需造模即可用其检测药物对银屑病作用[13]。

1.3.2实验动物分组与给药处理

将小鼠按照随机数字表法分为5组，即模型组，裸花紫珠提取物低（0.6 g/kg）、中（1.2 g/kg）、高（2.4 g/kg）剂量组，阳性药对照组，每组12只，灌胃给药连续7 d。

1.3.3 HE染色

将鼠尾组织取材后放入10%甲醛中固定，石蜡切片，将过夜的载有蜡片的玻片分别放入苏木精、盐酸酒精分化液、伊红液；再依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇（2次）、乙醇与二甲苯为1∶1溶液（2次），用中性树胶封片。晾干后显微镜下观察[13]。

1.3.4 Western blot

将组织蛋白样品经电泳、转膜、封闭、标记抗体Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2（1∶1000）后，用红外荧光扫描系统检测，以GAPDH作内参，拍照，并用图像分析软件odyssey1.2进行光密度积分值分析[14]。

1.3.5 Real-time PCR

将组织总RNA提取后逆转录，以β-actin作为内参，采用Applied Biosystems的SYBR？誖Green PCR Master Mix试剂盒步骤进行聚合酶链式反应。取cDNA（1 μL），依次加入SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 μL、ROX High（50×）0.4 μL、引物0.3 μL，用PCR-grade water补齐至20 μL，反应条件为：95℃ 10 min预变性，95℃ 15 s变性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，35个循环。最后使用ABI 7900荧光定量PCR仪进行定量PCR。Real-time PCR实验结果分析采用2-△△Ct方法[15]。各基因的引物序列见表1。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸花紫珠提取物对鼠尾颗粒层形成的影响

镜下观察HE染色鼠尾切片的颗粒层状态，计数每一百个鳞片上皮中有完整颗粒层的鳞片个数，共计数300，取平均值。与模型组比较，中、高剂量组裸花紫珠提取物和阳性药对照组完整颗粒层的鳞片数目增多（P < 0.05）。见图1。

2.2 裸花紫珠提取物对鼠尾组织凋亡蛋白表达的影响

取裸花紫珠提取物中、高剂量组鼠尾组织提取蛋白，应用Western blot检测Caspase3、C-Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达改变。结果表明，与模型组比较，裸花紫珠提取物中、高剂量组促凋亡蛋白Caspase3表达差异无统计学意义（P > 0.05）、C-Caspase3、Bax表达均上调（P < 0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達下调（P < 0.05）。见图2～3。

2.3 裸花紫珠提取物对鼠尾组织凋亡基因表达的影响

应用RT-PCR技术检测鼠尾组织凋亡基因mRNA表达情况。结果表明，与模型组比较，裸花紫珠提取物中、高剂量组Caspase3、Bax基因mRNA表达量明显上调（P < 0.05），BCL-2 mRNA表达量明显下调（P < 0.05）。见图4。

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，也是一种摧残患者身心的严重疾病[16]。经查阅文献，本研究选择小鼠鼠尾银屑病模型[17]，由于小鼠鼠尾颗粒层的缺失，其与银屑病的生理和病理状态十分相似，是天然的银屑病模型。如果药物促使颗粒层完整，可以说明此种药物具有抗银屑病作用[18]。因此选择此种稳定的银屑病模型，评价裸花紫珠提取物的药效作用。HE染色结果显示裸花紫珠提取物组鼠尾颗粒层的完整度高于模型组，提示裸花紫珠提取物具有抗银屑病作用，并且可能与促进细胞的凋亡有关。

裸花紫珠的药理作用包括消炎、解毒、收敛、止血，也被用于各种皮肤病的治疗，裸花紫珠可以有效缓解炎症皮损、疼痛，在局部抑制色素沉积，防止瘢痕形成[19]。在治疗痤疮时，裸花紫珠可以有效抑制细菌增殖，同时使毛囊闭塞的情况得到缓解，进而达到治疗目的[20]。但是，裸花紫珠对于银屑病的作用及相关的作用机制并没有文献报道。凋亡的发生过程中，一般伴随多种蛋白表达的上调或者下调[21]，Caspase家族和BCL-2家族是细胞与凋亡相关重要的蛋白家族，促凋亡蛋白Caspase3和Bax上调可以诱导细胞凋亡，而抗凋亡蛋白BCL-2上调会抑制细胞凋亡。通过Western blot方法检测凋亡相关蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax在裸花紫珠提取物组的表达情况，发现其表达均明显增高；而BCL-2表达均显著下降。同时，Real-time PCR结果显示裸花紫珠提取物组促凋亡基因Caspase3、Bax的mRNA表达明显上调，而抗凋亡基因BCL-2mRNA表达明显下调，提示裸花紫珠提取物诱导细胞凋亡可能是通过影响凋亡蛋白及其基因表达而实现的。

本研究希望更多研究者注意到裸花紫珠治疗银屑病的药用价值，对其相关作用机制深入探讨，进而使裸花紫珠应用得到积极推广，让更多患者受益。

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（收稿日期：2018-04-17 本文编辑：李岳泽）