响应曲面法优化风香鸡腿的酶解工艺

刘霞，金巧，甘志凯

(南昌理工学院，南昌 330000)

风干禽肉制品是我国传统腌腊肉制品之一，历史悠久，因其腊香味十足而深受广大人民群众的喜爱[1]。过去，风干禽肉制品的制作通常是在温度和湿度较低的冬季进行，常常需要1～2个月的时间，这极大地限制了风干禽肉制品的产量和销售[2]。目前，工业化加工生产风干禽肉制品，主要采用现代化的控温控湿大型设备，规模程序化控制工艺参数，如温度、湿度、风速等，从而实现风干禽肉制品的全年化生产[3]。但是，现代化设备生产出的风干禽肉制品仍然存在质构过硬、风味相对单一和过度氧化等问题。同时，在产品贮藏过程中脂肪氧化的持续进行，会使产品产生哈败味，色泽变暗，产生不良气味，从而影响产品的营养价值和贮藏安全[4]。

为减缓风干禽肉制品的过度氧化变质和避免氧化变质带来的危害发生，可采用辐照和气调包装等物理措施，还可人为添加抗氧化剂，如茶多酚、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚。但是部分添加抗氧化剂具有一定的副作用，使用上也受温度和溶剂的局限[5,6]。因此，更多的研究者将目光转移到安全性高、无副作用并有较强抗氧化能力的天然抗氧化剂上，而用动物蛋白酶法制备抗氧化肽已然成为研究热点之一[7,8]。

蛋白质水解是风干类肉质品加工过程中重要的生化变化之一，蛋白质在蛋白水解酶的作用下生产多肽，多肽在肽酶的作用下进一步水解产生游离氨基酸，而小分子多肽和游离氨基酸是肉质品的直接呈味物质或重要的风味前体物质[9]。此外，某些特殊片段的肽段，在蛋白质母链中不表现出抗氧化性，但可以通过水解作用被释放出来，呈现出一定的抗氧化活性。在发酵大豆、金华火腿和西班牙干腌火腿中均鉴定出具有抗氧化能力的肽段[10,11]。在风干类肉制品成熟过程中，内生酶和微生物酶的存在发挥着巨大的作用，有助于脂肪和蛋白质的水解，其产物是风味和呈味物质的前体物质[12]。然而，内生酶发挥作用需要极其严格的制作工艺条件[13]，而微生物蛋白酶的作用无法合理地量化控制，因此国内外的研究方向逐渐转移到将外源蛋白酶添加到风干肉制品中[14]，加速蛋白质水解，促进抗氧化肽的生成，以期改善肉制品的滋味和香气，并对蛋白质和脂肪起到抗氧化作用[15]，同时还能提高产品的嫩度[16,17]。岑宁等利用木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、CaCl2这3种成分的复合酶液制作风鹅[18]，发现复合酶液能够有效降低风鹅的剪切力，促进蛋白质的水解，增加可溶性蛋白含量，提高产品的食用品质。Rawdkuen将牛角瓜中提取的粗蛋白酶液处理牛肉、猪肉和鸡胸肉[19]，发现加酶处理能够提高牛肉、猪肉和鸡胸肉的嫩度，促进可溶性蛋白的释放和增加可溶性小肽的含量。

风味蛋白酶(Flavourzyme)是一种真菌蛋白酶和肽酶的复合体，能够彻底酶解动植物蛋白质[20]，pH水解条件为中性或微酸性，可以增加肉制品中的风味小肽和氨基酸的含量，进而增进和改善肉制品的风味。因此，本研究选用风味蛋白酶为工具酶，以抗氧化能力和感官总体可接受度为基准，设计相应的单因素试验和响应曲面试验来优化风香鸡腿的酶解工艺，以期为工业化生产风味浓郁且具有抗氧化活性的风香鸡腿产品提供一定的理论依据，为外源蛋白酶在风干类肉制品的生产和开发方面提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三黄鸡：山东天禧牧业公司。

风味蛋白酶：Flavourzyme 500 mg，食品级，活力500 LAP U/g，诺维信(中国)生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、无水乙醇、柠檬酸、柠檬酸钾：分析纯。

1.2 仪器与设备

BE1998Q高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司； SDE-410分散机 德国IKA公司；M2e酶标仪美国 MD公司；GM200刀式混合研磨机 德国Restch公司；IN-2450紫外分光光度计 日本Shimadzu公司；DC800-FB-E真空包装机 快尔卫包装机公司；KBF115-pgm型电热鼓风干燥箱 德国Binder公司。

1.3 方法

1.3.1 风香鸡腿加工流程[21]

1.3.1.1 原料

将冷冻鸡腿于4 ℃过夜解冻，修整外形，清洗血迹，挂晒晾干。

1.3.1.2 酶解

将鸡腿肉随机分组，分别注射相应质量分数的酶解液，按压鸡腿肉10 min，于适宜温度下进行保温反应。

1.3.1.3 腌制

将鸡腿肉浸入腌制液(食盐10%，m/V)中，每1 kg鸡腿肉配制1 L腌制液，4 ℃腌制12 h，腌制结束后挂晒晾干。

1.3.1.4 风干

将腌制好的鸡腿肉放入恒温恒湿箱中风干成熟。风干工艺为温度8 ℃、湿度50%、时间72 h。

1.3.1.5 包装

风干成熟后，取出鸡腿肉，待其冷却至室温，用真空包装袋包装，储存于4 ℃备用。

1.3.2 试验设计

1.3.2.1 酶解条件的单因素试验设计

a.酶浓度对风香鸡腿抗氧化能力和感官品质的影响

酶解液的质量分数分别为0(C)，0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，于(50±1)℃下保温反应2.5 h。

b.酶解时间对风香鸡腿抗氧化能力和感官品质的影响

酶解液的质量分数为0.15%，于(50±1)℃下分别保温反应0(C)，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。

c.酶解温度对风香鸡腿抗氧化能力和感官品质的影响

酶解液的质量分数为0.15%，分别于35，40，45，50，55 ℃条件下保温反应2.5 h。

1.3.2.2 酶解条件的响应曲面试验设计

根据酶解条件单因素试验的结果，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[22]，以酶浓度、酶解时间和酶解温度3个因素进行响应曲面试验，确定最优的酶解工艺参数。试验因素水平见表1。

表1 响应曲面试验因素水平表

1.3.3 DPPH自由基清除率的测定

肽的提取与分离[23]：风香鸡腿产品经研磨机绞碎，称取5 g，加入35 mL 50 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钾缓冲溶液(pH 6.0)，冰水浴中高速匀浆15 s，间隔5 s，匀浆2次。4 ℃条件下静置2 h，4 ℃下12000 g离心15 min，过滤，取上清液，用柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液定容至50 mL。

DPPH自由基清除率[24]：取1.0 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，加入1.0 mL样品溶液，混匀，黑暗处反应40 min，测定OD517处吸光度；对照组为1.0 mL DPPH溶液混合1.0 mL无水乙醇；空白为1.0 mL无水乙醇加入1.0 mL肽液。用1.0 mL无水乙醇加1.0 mL去离子水调零。

1.3.4 感官评定

感官评定由本实验室16位受过训练的食品专业研究生完成[25]。采用盲评积分的方式，对风香鸡腿的色泽、香气、滋味、质地和感官总体可接受度进行感官评价。评分的标准采用9点评分法：1分表示极不喜欢，5分表示普通，7分表示喜欢，9分表示极喜欢。

1.4 数据处理

数据由Excel 2010整理，采用SAS 16.8多国语言版统计分析，用One-Way ANOVA方法进行方差分析，差异显著性采用LSD多重比较进行判定，显著水平设为P<0.05；应用Design-Expert 8.0.6进行响应曲面优化试验设计。结果均表示为平均值±标准误差，n=3。表格中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 酶浓度单因素试验

2.1.1 酶浓度对风香鸡腿抗氧化能力的影响

本节数据来源于本实验室前期研究，由图1可知，酶浓度对风香鸡腿的DPPH自由基清除率有显著影响(P<0.05)[26]。随着酶浓度的增加，DPPH自由基清除率先显著增加后基本保持不变。这可能是因为在底物充足的条件下，增加酶浓度可提高底物和风味蛋白酶的结合，进而加快反应速率，此时酶浓度越高，产生的抗氧化肽的含量就越多。但是，当酶浓度超过0.20%时，底物已被完全饱和，此时已经生成的抗氧化活性的肽段正在被风味蛋白酶逐渐降解为无活性的氨基酸[27]，所以DDPH自由基清除率的增加趋势变缓。

2.1.2 酶浓度对风香鸡腿感官评定的影响

表2 风味蛋白酶添加量对风香鸡腿感官品质的影响

由表2可知，酶浓度对风香鸡腿的色泽得分无显著影响(P>0.05)，而滋味和香气的得分则显著高于对照组，且各处理组之间得分没有显著差异(P>0.05)。酶浓度对风香鸡腿的质地和总体可接受度得分的影响存在显著差异(P<0.05)。随着酶浓度的增加(0～0.15%)，总体可接受度得分逐渐上升，当酶浓度为0.15%时达到最高值。质地在酶浓度为0.10%和0.15%时得到最高分，当酶浓度为0.20%～0.25%时，香气和滋味的得分呈现下降的趋势，质地的得分则显著降低(P<0.05)。这表明风味蛋白酶促进蛋白质降解产生多肽和氨基酸，增加了产品的滋味和香气[28]。综合抗氧化能力和感官评定考虑，确定最佳的酶浓度为0.15%。

2.2 酶解时间单因素试验

2.2.1 酶解时间对风香鸡腿抗氧化能力的影响

图2 酶解时间对风香鸡腿抗氧化能力的影响

由图2可知，酶解时间对风香鸡腿的DPPH自由基清除率有显著影响(P<0.05)。随着酶解时间的增加(0～2.5 h)，DPPH自由基清除能力不断上升。酶解时间为2.5 h，DPPH自由基清除率达到最大值(69.13%)，继续延长酶解时间至3 h，DPPH自由基清除能力不再增加，略有降低。这可能是因为反应前期反应底物含量较高，酶解反应较快，产生的抗氧化肽含量逐渐增多，从而使DPPH自由基清除力增加，但随着酶解时间的延长，具有抗氧化能力的肽段进一步被风味蛋白酶降解，从而使抗氧化活性下降。

2.2.2 酶解时间对风香鸡腿感官评定的影响

表3 酶解时间对风香鸡腿感官品质的影响

由表3可知，酶解时间对风香鸡腿的色泽得分无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，各处理组的滋味和香气得分显著高于对照组(P<0.05)，不同处理组间得分没有显著差异(P>0.05)。质地和总体可接受度得分随着酶解时间的增加先升高后降低，质地和总体可接受度的最高分都出现在2.5 h处理组。继续延长风味蛋白酶的酶解时间，风香鸡腿的香气和滋味得分开始略微下降，质地和总体可接受度的得分显著降低(P<0.05)。综合抗氧化能力和感官评定考虑，确定最佳的酶解时间为2.5 h。

2.3 酶解温度单因素试验

2.3.1 酶解温度对风香鸡腿抗氧化能力的影响

图3 酶解温度对风香鸡腿抗氧化能力的影响

由图3可知，与对照组相比，不同酶解温度对风香鸡腿的DPPH自由基清除率有显著影响(P<0.05)。DPPH自由基清除能力随着酶解温度的升高逐渐上升，到50 ℃时达到最大值。酶解温度为55 ℃时， DPPH自由基清除能力不再增加，略有降低。这是因为温度会影响风味蛋白酶活性中心的分子构象，从而影响反应进程的速率，当温度低于酶的最适温度时，酶活性较低，反应速率慢；当温度高于酶的最适温度时，酶活性逐渐降低到最后酶彻底变性失活。

2.3.2 酶解温度对风香鸡腿感官评定的影响

表4 酶解温度对风香鸡腿感官品质的影响

由表4可知，酶解温度对风香鸡腿的色泽得分无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，各处理组的滋味和香气得分显著高于对照组(P<0.05)，不同处理组间得分没有显著差异(P>0.05)。随着酶解温度的升高(35～50 ℃)，风香鸡腿的质地和总体可接受度得分逐渐升高，到50 ℃时达到最大值。当酶解温度为55 ℃时，风香鸡腿的质地和总体可接受度得分显著降低(P<0.05)，香气和滋味得分略微下降。综合抗氧化能力和感官评定考虑，确定最佳的酶解温度为50 ℃。

2.4 响应曲面试验

2.4.1 响应曲面试验设计及结果

选取酶浓度X1、酶解时间 X2、酶解温度X3这3个因素，以DPPH自由基清除率和感官评定的总体可接受度为Y，对风香鸡腿的酶解工艺参数进行响应面试验，设计17个组别，具体试验设计及结果见表 5。

表5 响应面试验设计及试验结果

利用Design-Expert 8.0.6软件对表5中试验数据进行多元回归拟合分析，得到二次多项式回归模型方程(1)和(2)：

Y1=69.37+2.08X1-1.60X2-2.25X3-4.04X1X2-1.28X1X3-2.94X2X3-9.53X12-7.42X22-0.93X32。

(1)

Y2=7.75+0.13X1-0.11X2-0.20X3-0.27X1X2-0.012X1X3-0.12X2X3-0.81X12-0.77X22-0.37X32。

(2)

对回归模型(1)和(2)进行方差分析，结果见表6和表7。结果表明，回归模型(1)的P值<0.0001，说明模型(1)极显著，失拟相的P值=0.3561>0.05，说明没有失拟因素，与回归模型(2)的结果类似。这说明模型(1)和(2)的拟合度高，试验误差小，回归模型较理想，可以利用上述2个回归方程对样品的DPPH自由基清除率和总体接受度进行分析预测。

表6 DPPH自由基清除率回归模型方差分析

注：“*”表示显著水平(P<0.05)；“**”表示极显著水平(P<0.01)。

表7 感官总体可接受度回归模型方差分析

注：“*”表示显著水平(P<0.05)；“**”表示极显著水平(P<0.01)。

方差结果表明，一次项风味蛋白酶浓度(X1)、酶解时间(X2)、酶解温度(X3)和交互项X1X2，X2X3、二次项X12，X22对DPPH自由基清除率回归模型有极显著影响，交互项X1X3对DPPH自由基清除率回归模型影响显著(见表6)。一次项风味蛋白酶浓度(X1)、交互项X1X2和二次项X12，X22，X32对感官总体接受度回归模型有极显著影响，一次项X1对感官可接受度回归模型影响显著(见表7)。由回归方程的各项系数可知，酶解温度(X3)对DPPH自由基清除率和感官总体可接受程度的贡献最大，其次是酶浓度(X1)，酶解时间(X2)的贡献最小。软件预测模型分析得到：风味蛋白酶酶解制备风香鸡腿的最佳工艺条件为：酶浓度0.16%，酶解时间2.47 h，酶解温度48 ℃。

2.4.2 酶浓度、酶解时间和酶解温度对风香鸡腿抗氧化能力的影响

图4 风味蛋白酶浓度和酶解时间对风香鸡腿DPPH自由基清除率的影响

由图4可知，固定酶解温度为中心点水平时，风味蛋白酶浓度、酶解时间及其交互作用对产品的DPPH自由基清除率有极显著影响(P<0.01)。当风味蛋白酶浓度一定时，风香鸡腿的DPPH自由基清除率会随着酶解时间的增加而先升高后降低，在2.47 h左右时达到最大值；同样，当酶解时间一定时，风香鸡腿的DPPH自由基清除率会随着风味蛋白酶浓度的增加而先升高后降低，在0.16%左右时达到最大值。

图5 风味蛋白酶浓度和酶解温度对风香鸡腿DPPH自由基清除率的影响

由图5可知，固定酶解时间(2.5 h)为中心点水平时，风味蛋白酶浓度、酶解温度对产品的DPPH自由基清除率有极显著影响(P<0.01)，两者的交互作用对产品的DPPH自由基清除率影响显著(P<0.05)。当风味蛋白酶浓度一定时，风香鸡腿的DPPH自由基清除率会随着酶解温度的增加而先升高后逐渐降低；当酶解温度一定时，风香鸡腿的DPPH自由基清除率会随着风味蛋白酶浓度的增加而先升高后降低。

图6 酶解温度和酶解时间对风香鸡腿DPPH自由基清除率的影响

由图6可知，固定风味蛋白酶浓度(0.15%)为中心点水平时，酶解温度、酶解时间和其交互作用对产品的DPPH自由基清除率有极显著影响(P<0.01)。当酶解温度一定时，随着酶解时间的增加，产品的DPPH自由基清除率先增加后逐渐降低；当酶解时间一定时，随着酶解温度的增加，产品的DPPH自由基清除率先升高后逐渐降低。

2.4.3 酶浓度、酶解时间和酶解温度对风香鸡腿感官评定的影响

图7 风味蛋白酶浓度和酶解时间对风香鸡腿感官总体可接受度的影响

由图7可知，固定酶解温度为中心点水平时，风味蛋白酶浓度对产品的感官总体可接受度影响显著(P<0.05)，风味蛋白酶浓度和酶解时间的交互作用对产品的感官总体可接受度有极显著影响(P<0.01)。当风味蛋白酶浓度一定时，随着酶解时间的增加，感官总体可接受度先升高后降低；当酶解时间一定时，随着风味蛋白酶浓度的增加，产品的感官总体可接受度先升高后降低。

图8 风味蛋白酶浓度和酶解温度对风香鸡腿感官总体可接受度的影响

由图8可知，固定酶解时间(2.5 h)为中心点水平时，酶解温度对产品的感官总体可接受度有极显著影响(P<0.01)，风味蛋白酶浓度对产品的感官总体可接受度影响显著(P<0.05)，两者的交互作用对产品的感官总体可接受度影响不显著(P>0.05)。当风味蛋白酶浓度一定时，随着酶解温度的增加，产品的感官总体可接受度先升高后降低；当酶解温度一定时，随着风味蛋白酶浓度的增加，产品的感官总体可接受度先升高后降低。

图9 酶解温度和酶解时间对风香鸡腿感官总体可接受度的影响

由图9可知，固定风味蛋白酶浓度(0.15%)为中心点水平时，酶解温度对产品的感官总体可接受度有极显著影响(P<0.01)，酶解时间和酶解温度的交互作用对产品的感官总体可接受度影响不显著(P>0.05)。当酶解温度一定时，随着酶解时间的增加，产品的感官总体可接受度先增加后降低；当酶解时间一定时，随着酶解温度的增加，产品的感官总体可接受度先升高后降低。

2.5 优化验证试验

在优化工艺下，与对照组相比，风香鸡腿的DPPH自由基清除能力有了很大提高，感官总体可接受度也有所改善。DPPH自由基清除率与预测理论值70.30%的相对误差为1.66%，感官总体可接受度与预测理论值7.78的相对误差为3.60%，两者可靠性均较高，见表8。在风香鸡腿加工过程中，利用适当浓度的风味蛋白酶酶解，控制好酶解的时间和温度，在能提高感官总体可接受度的同时，使风香鸡腿的DPPH自由基清除能力提升约2.6倍。

表8 优化条件验证试验

3 结论

在单因素的基础上，利用响应曲面试验，建立了风味蛋白酶浓度、酶解时间和酶解温度工艺条件的二次模型(1)和(2)，模型(1)和(2)的决定系数R2值分别为0.9928和0.9840，模型的拟合度较高，失拟检验不显著，可用于预测分析风味蛋白酶浓度、酶解时间和酶解温度对感官总体可接受度和DPPH自由基清除率的影响。优化所得最佳工艺参数为：风味蛋白酶浓度0.16%，酶解时间2.47 h，酶解温度48 ℃，优化得到的工艺显著提高了风香鸡腿的感官总体可接受度，并且极大地提高了产品的抗氧化能力。