中国传统发酵食品微生物多样性及其代谢研究进展

解万翠，尹超，宋琳，许志颖，于文露，贾俊涛, 赵宏伟，张俊逸，李钰金，杨锡洪*

1(青岛科技大学 海洋科学与生物工程学院,山东 青岛,266042) 2(青岛海关出入境检验检疫局，山东 青岛，266002) 3(青岛信和源生物科技有限公司，山东 青岛,266002) 4(泰祥集团,山东省冷冻调理食品加工技术企业重点实验室，山东 荣成,264303)

发酵是古老的食品加工和保存方式之一[1]，在有益微生物及其酶的作用下，食品原料中的糖、脂质和蛋白质等主要的营养物质被分解，转化为原料在发酵前所不具有的特殊风味及营养成分。传统发酵食品在中国有着悠久的历史，是中华饮食文化的重要体现，漫长的发展历史造就了其原料多样、产品种类繁复[2]，如酒类、发酵调味品等，其原料及产品主要风味特点如表1所示。

表1 常见传统发酵食品原料及主要风味特点Table 1 Sources of traditional fermented foods products

传统发酵食品生产过程中，各种微生物在原料中自发地富集，从而逐步形成一个较为稳定的菌群及生态环境，原材料在这种发酵环境下，生产人们所期望的食物，在食物中产生新的能够促进人体健康的化合物，同时去除具有不利健康潜力的物质[3]，因此微生物被认为是决定发酵食品品质好坏的关键因素，且传统发酵食品的发酵系统是相对开放的环境，致使其蕴藏有丰富的微生物资源，在长期的发酵驯化过程中，筛选保留下了丰富优良的菌相资源。为揭示微生物在食品发酵过程中的发酵机理，目前的许多研究聚焦于发酵食品微生物多样性及其结构演替规律，以期对今后发酵食品的工业化、标准化等提供理论依据。本文重点综述了不同传统发酵食品中菌相结构、演替规律及其代谢规律，并对发酵食品未来研究方向进行展望。

1 传统发酵食品中微生物的多样性和演变

传统发酵食品产品质量特性会因环境和人为因素的不同而有所差异，其中复杂的菌相组成使得人们无法有效地对发酵食品中微生物的多样性及其结构在发酵过程中的演替规律进行分析，传统可培养方法无法满足人们对发酵食品中微生物多样性的研究，而随着分子生物学和生物信息学的快速发展，非培养方法如微生物组学等技术可以有效地揭示微生物是如何影响食品发酵过程的。

自20世纪90年代，非培养的研究方法逐渐被应用于食品发酵微生物的研究领域，如浓度梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electro phoresis, PCR-DGGE)法使用较为广泛，使用PCR-DGGE对发酵食品中菌相研究的论文数量从20世纪90年代以后呈指数状态增长，通过对这些论文的研究结果分析，PCR-DGGE能够有效地分析发酵食品中微生物的多样性及菌相结构演替规律[4]。近年来，随着测序技术的发展及成本的降低，高通量测序越来越多地应用于检测发酵食品中微生物基因组，以揭示其组成及演替规律。实验方法的进步推进了对传统发酵食品中复杂微生物菌群结构变化的研究。

1.1 传统发酵豆制品

传统发酵豆制品是亚洲的特色食品，其历史悠久、种类繁多。豆豉、豆酱、腐乳、酱油等是中国传统发酵豆制品的典型代表。传统发酵豆制品的生产过程一般被认为是在开放环境下进行的，导致其菌相组成复杂多变。发酵原料在发酵过程中发生一系列复杂的生化反应，不仅赋予了其独特的风味，同时提高了豆制品的功能性和保健功能。普遍认为，在豆制品发酵过程中，微生物及其分泌的胞外酶对其风味物质的产生、营养物质的变化及食品质地的形成等都有着至关重要的影响。

参与发酵的菌相复杂，既包括有利于发酵的菌种，也包括导致腐败甚至对人有害的菌种，因此分析其发酵过程中菌相结构变化，揭示微生物种类和遗传的多样性，可对传统发酵豆制品的发酵调控及品质提高有重要的指导意义。LI[5]等通过高通量测序的方法对中国传统豆类发酵食品-豆瓣酱中的微生物菌落结构进行了分析，结果表明除去乳杆菌属和不动杆菌属在发酵过程中发生剧烈变化外，其他菌种相对稳定；在豆瓣酱中的优势微生物只包括四联球菌(Tetragenococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链球菌属(Streptococcus)。耿予欢[6]等采用了PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)指纹图谱技术，系统地分析了高盐稀醪发酵工艺生产的广东酱油发酵过程中微生物组成的变化趋势，结果发现在酱油酿造的过程中微生物结构组成呈现出由复杂到简单的演替规律，酱油高盐的生产发酵环境对大多数细菌有着较强的抑制作用。同样，对豆豉和腐乳中菌相组成的研究结果分析可知，豆豉中参与发酵的芽孢杆菌的主要优势微生物是枯草芽孢杆菌[7]，而腐乳中主要优势微生物为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌[8]。

1.2 传统发酵乳制品

内蒙、西藏和新疆等地区的传统发酵乳是中国传统发酵乳制品的典型代表。传统的发酵乳制品表现出明显的地理性特征，微生物的种群结构和数量与当地的气候、环境以及奶源等因素相关[9]，对奶酪等传统发酵乳制品的微生物菌群结构的研究不仅能够揭示其发酵原理，更好地对发酵进程和品质进行控制，还可能有助于其产地溯源系统的建立。

智楠楠[10]等利用Illumina Miseq深度测序对7个地区的9种酸奶样品中的微生物组成进行了研究分析，结果显示酸奶中细菌主要为厚壁菌门，而对细菌组成属水平进行分析发现链球菌属(Streptococcus)为主要的优势微生物，占87.1%，其次为乳杆菌属(Lactobacillus) 仅占10.3%；杨洁等[11]对从新疆采集的22个酸奶样品中乳酸菌菌种构成进行了研究，结果显示德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.)为主要的优势菌，占82%。对传统发酵酸奶中主要优势菌群的检测结果显示，不同地区、不同奶源也会对酸奶中微生物菌群结构有着明显的影响，如张敏[12]等运用高通量测序技术，对新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州和塔城地区不同奶源及其发酵乳产品的7 种乳品中菌相结构进行了分析，结果显示地区和奶源的不同对发酵乳产品中的菌相组成有着显著的影响。对获得欧盟原产地保护的意大利Ragusano地区奶酪中微生物菌群结构的研究显示乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属和明串珠菌属是主要的优势菌群，同时检测出低水平的假单胞菌属和酵母菌，而从未检出大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌，说明奶酪发酵条件有效地抑制了有害菌的生长和繁殖[13]。发酵乳制品中微生物复杂多样，不同乳制品菌种同质化程度较低，代谢产物不尽相同，工业生产过程中根据代谢机理进行发酵工艺控制显得尤为重要。

1.3 传统发酵粮食产品

1.3.1 食醋

山西老陈醋、镇江香醋是中国传统发酵谷物类食品的典型代表，且早已实现工业化生产，它们的生产是一个相对开放的环境，有众多的微生物参与其中，这就造成了其复杂的微生物结构组成，现代分子生物学方法的应用可以有效地对不同发酵阶段菌相组成及其演替规律进行分析。

山西老陈醋的生产发酵过程主要分为制曲、糖化、酒精发酵和醋酸发酵四步，不同阶段因为酿造工艺的原因，菌相结构会发生剧烈变化，NIE[14]等对不同阶段中不同发酵天数的样品进行微生物鉴定统计，结果显示不同阶段微生物的菌群结构存在着显著的差异性。从整个发酵过程中看，大曲到酒精发酵期间，细菌和真菌多样性是呈现减少的趋势，而醋酸发酵前期菌群数量由于醋醅的接入而增加，但随着发酵的进行乳酸菌和醋酸菌占据优势，抑制其他微生物的生长，从而使菌种数量下降；为解析镇江香醋醋酸发酵阶段醋醅中主要功能微生物的演替规律，陶京兰等[15]建立了有效的实时荧光定量PCR方法，对主要的优势微生物进行定量分析，结构发现醋醅中优势微生物为醋酸菌、乳酸菌和酵母，三者就占细菌和真菌总和的80%以上，在醋酸发酵阶段醋酸菌和乳酸菌数量均呈现出先增加后降低，而后保持一定水平直至发酵结束的趋势。

1.3.2 酒类

传统发酵酒类主要有黄酒、米酒、白酒等酒种。我国发酵酒历史悠久，具有独特的发酵工艺和丰富的酒体。“曲是酒之骨”，充分说明了在白酒酿造生产过程中微生物所起到的至关重要的作用，酒中特殊风味的产生及营养成分的变化受曲中的菌相组成的影响，因此很多学者专家在酿酒功能菌筛选、鉴定、应用上做了大量的研究。

王莉等[16]采用高通量测序技术分析了酱香型白酒发酵窖池中不同阶段的窖底泥及环境土样中的细菌结构组成，结果发现与窖底泥中的细菌组成相比，酒厂周围环境土壤中的细菌组成更为丰富多样，说明在土壤被逐渐驯化成酒厂中窖底泥的进程中，细菌种类多样性逐渐下降，逐渐形成以乳杆菌科(Lactobacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)等厌氧微生物为主的优势菌群。而雷振河等[17]分析了酿造清香型白酒所用大曲以及酒醅中的菌相组成，酒醅中优势细菌主要包括肠杆菌科、醋酸杆菌科等占原核微生物70 %以上，优势真核微生物主要包括双足囊菌科、假丝酵母和毕赤酵母科等。

1.4 传统发酵水产食品

发酵水产食品主要是指通过在新鲜鱼、虾、蟹、贝类等水产品中加入较高含量的食盐，然后经过微生物长时间发酵而成的食品，主要包括虾油、虾酱、鱼酱油、鱼露等。不同地区传统虾酱中微生物组成因地区和制备工艺以及原料的不同而存在差异，如印度尼西亚传统虾酱中参与发酵的主要乳酸菌是片球菌属(Pediococcushalophilus和Pediococcusdextrinicus)[18]，而戴玲瑛[19]通过高通量测序技术对虾酱中细菌群落结构及多样性进行剖析发现，发光杆菌属是主要的优势菌属，所占比例达到71.94%；其次是弧菌属，比例为12.54%。此外，嗜盐菌[20]以及产蛋白酶霉菌和酵母菌[21]等有利于改善快速发酵虾酱风味的微生物均被分离鉴定而用于虾酱快速发酵技术改进和推进其工业化的研究中。同样，在鱼露生产过程中研究者们也通过对鱼露发酵过程中菌相结构变化规律的研究，从而选用耐盐细菌作为发酵剂或通过添加蛋白酶以达到缩短鱼露发酵周期、提高鱼露产品质量的目的[22]，黄紫燕[23]对不同发酵阶段传统发酵工艺制作的鱼露中微生物的菌相组成进行了剖析，证实了乳酸菌以及酵母菌是主要的优势微生物，结合各项理化指标及游离氨基酸的变化规律进行分析发现，乳酸菌和酵母菌的变化趋势与各项指标的变化规律有明显的相关性。发酵技术在水产品加工中的应用，可以有效地利用低值水产品生产高值化食品，对水产品的利用以及有效的保存都有很大的促进作用[25]。传统发酵中微生物多样性及其群落结构动态化变化的研究，可以有效地设计发酵剂和优化发酵条件以实现其工业化生产。

2 传统发酵食品微生物的代谢特点

传统发酵食品具有独特的风味和丰富的营养成分，且某些发酵食品中生物活性物质对人体健康有着积极的作用，其独特的风味及营养成分主要是原材料在微生物及酶的作用下转化形成的，其发酵过程及物质转化概述如图1所示，而在发酵过程中微生物的代谢对发酵食品中的生物活性物质、食品特征以及风味等起着关键作用，因此对传统发酵食品中微生物代谢的研究能够更好地揭示微生物在发酵过程中的主要作用，分析微生物与代谢物之间的关系可以更好地掌握微生物发酵机制，对产品的质量控制和工业化提供理论依据[3]。

图1 发酵食品发酵过程及物质转化概述[2]Fig.1 Overview of the fermentation process andtransformation of fermentation foods

通过分析发酵食品菌相组成与代谢物之间的相关性，从而找到发酵体系中的功能微生物群[26]，这种方法是寻找复杂发酵系统中核心微生物群的主要方法之一。如WU[27]等为了研究镇江香醋中微生物群落代谢形成风味的机制，利用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME/GC-MS)对样品中成分进行检测，通过宏基因组测序揭示微生物分类和功能组成，构建了香醋中微生物群对底物分解和主要风味形成的代谢网络，以及分析了不同代谢途径的微生物分布差异；王鹏[28]等为揭示白酒发酵过程中核心微生物群，通过计算白酒发酵过程中丰度占比前20的细菌属及真菌属与61种代谢物之间的Spearman相关系数，发现在白酒酒醅发酵过程中，比较重要的代谢产物贡献者是Lactobacillus、Saccharomyces和Candida；对奶酪中微生物菌群结构和数量研究的基础上，通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)等检测手段对奶酪中的风味物质检测，通过统计学数据分析建立起了微生物与代谢产物之间的联系(见表2)，对奶酪发酵工艺改进提供了理论支撑。蟹膏[29]、鱼酱[30]以及食醋[31]等传统发酵食品中微生物代谢特点或核心功能微生物也通过这种方法进行了研究。微生物代谢特点的研究及核心微生物的寻找可以对研究者采用工程化的理念设计出高效的多菌种体系提供理论基础[32-33]，从而构建出可控的多菌种发酵体系，实现传统发酵食品的高效而有目的性的生产。

表2 奶酪中微生物与代谢物之间的关系[13]Table 2 The relationship between microbes and metabolites in cheese

3 传统发酵食品微生物组学及其代谢的研究方法

在过去几年中，宏基因组和宏转录组测序被广泛地应用于发酵食品微生物组成及代谢的研究中，蛋白质组检测技术也出现在发酵食品代谢的相关研究论文中，应用这些组学技术并结合代谢组学分析，为深入地解析发酵食品中微生物组成及物质产生的分子机制提供了重要的方法技术支撑[34]。

3.1 宏基因组

基于高通量测序技术的宏基因组测序技术已经广泛地应用于包括发酵食品在内的各种环境微生物群落结构的研究中。与普通的rRNA测序不同，宏基因组测序是通过对环境中全部微生物进行提取总DNA，然后通过构建相关的基因组文库，采用基因组学的研究方法对环境样品中全部微生物的DNA组成及其群落特点进行研究，能够更好地揭示环境中微生物丰度，对丰度较低的微生物也能有效地检出，同时有利于新物种的发现[35]。

LI[36]等通过16S rRNA基因的高通量测序比较了4种中国不同省份面团发酵起始剂样品以及不同发酵阶段面团中的细菌群落，实验结果能够揭示出不同省份样品的差异性以及发酵过程中细菌群落的演替，通过分析注释之后，宏基因组检测也可以解析可能有助于风味物质产生的功能基因簇和途径[37]。

3.2 宏转录组

同样基于高通量测序技术的宏转录组测序是针对活跃表达的基因的转录组，通过逆转录后得到cDNA序列，并对其进行测序。相较于宏基因测序技术，宏转录组测序能够直接对微生物在特定时间和区域表达活跃的基因进行检测，更加有效地解析微生物代谢与风味物质产生之间的关系。JUNG[38]在泡菜29 d的发酵过程中，从5个时间点取样提取总mRNA，使用Illumina GA IIx对表达的mRNA序列进行测序，结果表明在发酵早期Lac.mesenteroides的基因表达过程最为活跃，而Lb.sakei和W.koreensis的基因在发酵后期表达活跃，同时发现与碳水化合物转运和水解乳酸有关的许多基因被大量表达，实验结果有助于了解乳酸菌在发酵泡菜中的代谢相关基因的表达情况以及乳酸菌在不同发酵阶段菌种活跃情况。

3.3 宏蛋白质组

2004年，RODR GUEZ-VALERA提出了宏蛋白质组(metaproteome)的概念，即环境中所有生物的蛋白质组的总和[39]，宏蛋白质组的研究方法与传统的蛋白质组研究方法相似，其流程一般包括蛋白质样品制备、蛋白分离和蛋白鉴定等。采取合适的蛋白质提取方法、分离程序和先进的串联质谱法，宏蛋白质组学揭示了微生物群体中的主要功能蛋白质。宏蛋白质组学早已应用于各种环境微生物生态系统功能的研究中，但是多数发酵食品含有较高的蛋白质，对宏蛋白质组学应用于发酵食品微生物研究是一个不小的挑战。JI[40]等采用宏蛋白质组学方法对中国传统发酵鱼中的2 175个蛋白进行鉴定和注释，这些蛋白质属于19个门553个菌株，其中包括10个乳酸菌菌株，基于KEGG注释系统，发现1 217个蛋白质参与代谢途径，其中352个蛋白与氨基酸代谢相关，在链球菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属和假黄单胞菌属中鉴定了63种氨基酸降解相关蛋白，表明这些菌株可能是产生芳香化合物的菌种，宏蛋白质组学信息加深了对发酵鱼中微生物代谢模式的理解，可为改进发酵鱼的稳定性和适口性提供理论依据。对食醋发酵过程中宏蛋白质组采用2D-DIGE和质谱法进行研究，结果表明，大多数蛋白质在功能上与应激反应，TCA循环以及不同的代谢途径有关；宏蛋白质组学也在普洱茶和中国白酒等发酵食品中微生物组成及代谢的研究中[41]得到应用。

4 结论及展望

中国的传统发酵食品种类繁多，但是大部分仍沿用传统的生产工艺，存在生产规模较小、工艺粗糙、发酵过程不可控、发酵周期较长、而且极易受外界环境的影响，使产品质量很不稳定，从而带来一定的食品安全问题等，严重制约了传统发酵食品的发展。对微生物结构组成及演替规律、发酵代谢机理及规律进行详细的研究总结，可以更好地开发传统发酵食品，对推进传统发酵食品的产业化具有极其重要的意义。