PCNA和CyclinD1在腮腺恶性多形性腺瘤组织中的表达和临床意义

蒋尚飞，刘洪，颜成东，董海岛

江苏医药职业技术学院，江苏盐城 224000

腮腺混合瘤又称多形性腺瘤，含有腮腺组织、黏液和软骨样组织等多种组织。腮腺混合瘤为口腔颌面部最常见的肿瘤之一，好发于年轻人，起其组织来源于腮腺上皮，肿瘤内除上皮成分外，还常有黏液、软骨样组织等[1-2]。一般无明显自觉症状，生长缓慢，病程可达数年甚至数十年之久。目前认为多数多形性腺瘤为良性肿瘤，但是研究发现，多形性腺瘤的包膜不完整，手术切除后容易复发，因此，临床上更加倾向于把多形性腺瘤作为一种临界瘤[3-4]。关于多形性腺瘤的发病原因目前尚不清楚，目前的研究认为多种细胞因子如β-连环蛋白（β-catenin）[5]、p53[6]在多形性腺瘤以及恶性多形性腺瘤的表达水平出现了异常。该次研究使用免疫组织化学染色的方法对从2016年1月—2017年12月在盐城市第一人民医院病理科37例正常腮腺组织、37例多形性腺瘤组织和59例恶性多形性腺瘤组织检测增殖细胞核抗原 （Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）以及细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）的表达水平，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集盐城市第一人民医院口腔科收治的腮腺肿瘤患者96例，96例患者中男性患者49例，女性患者47例，年龄31～78岁。上述患者中最终确诊为腮腺多形性腺瘤37例，恶性多形性腺瘤59例，所有患者诊断经过病理诊断最终确认，并且在37例多形性腺瘤患者并选取腺瘤旁正常组织作为对照，上述腮腺组织根据组织学类型分为正常腮腺组、腮腺多形性腺瘤组和恶性多形性腺瘤组3个组别。所有患者术前均未进行任何抗肿瘤治疗。该研究经医院伦理委员会通过，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色

所用病理标本均经过4%多聚甲醛固定24 h后，梯度酒精脱水，石蜡包埋，使用石蜡切片机切片，片厚5 m，梯度酒精脱蜡后，使用微波进行抗原修复，一抗采用鼠抗人PCNA单克隆抗体和鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体（均为美国Santa Cruz公司生产）孵育过夜，清洗后二抗采用兔抗鼠IgG二抗（美国Santa Cruz公司生产）孵育30 min，清洗后使用 Elite-ABC（英国Vector公司生产）孵育30 min，清洗后加DAB溶液（中杉金桥公司生产）室温避光孵育5 min，苏木素复染20 sec，常规脱水透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察摄片，计算阳性面积比例。

1.3 免疫组织化学结果判定

每张切片随机选择10个高倍镜视野，每视野计数100个肿瘤细胞。光镜下观察Cyclin D1阳性表达定位于胞核，PCNA表达定位于胞质或胞核。分为4级(-):肿瘤或腺上皮细胞无棕黄色阳性染色。(+):阳性细胞数＜25%。(+++):阳性细胞数＞50%。(++):阳性细胞数在 25%～50%之间。 把(+)、(++)、(+++)均视作阳性。

1.4 统计方法

所有统计数据输入SPSS 18.0统计学软件进行统计分析，分别进行确切概率法进行统计分析，相关性分析采用Spearman分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCNA与Cyclin D1在腮腺不同组织学类型中阳性表达比较

正常腮腺组中，PCNA的阳性表达率为10.81%，多形性腺瘤组中，PCNA的阳性表达率为45.95%，恶性多形性腺瘤组中，PCNA的阳性率为83.05%。PCNA在正常腮腺组中的阳性表达率明显低于多形性腺瘤组和恶性多形性腺瘤组，均差异有统计学意义 （P＜0.05），PCNA在多形性腺瘤组中的阳性表达率也明显低于恶性多形性腺瘤组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。正常腮腺组中，Cyclin D1的阳性表达率为2.77%，多形性腺瘤组中，Cyclin D1的阳性表达率为43.24%，恶性多形性腺瘤组中，Cyclin D1的阳性率为86.44%。Cyclin D1在正常腮腺组中的阳性表达率明显低于多形性腺瘤组和恶性多形性腺瘤组，均差异有统计学意义 （P＜0.05），Cyclin D1在多形性腺瘤组中的阳性表达率也明显低于恶性多形性腺瘤组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 1。

表1 PCNA与Cyclin D1在腮腺不同组织学类型中阳性表达比较

2.2 PCNA与Cyclin D1在不同临床特征的恶性多形性腺瘤组织表达情况

PCNA与Cyclin D1在不同年龄、不同性别的恶性多形性腺瘤组织中的阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05）。 PCNA 与 Cyclin D1在肿瘤直径＞4 cm、TNM分期为III，IV期、有淋巴结转移的恶性多形性腺瘤组织中的阳性表达率高于肿瘤直径≤4 cm、TNM分期为I，II期、无淋巴结转移的恶性多形性腺瘤组织中的阳性表达率，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 Cyclin D1与PCNA在恶性多形性腺瘤的表达相关性

在46例Cyclin D1阳性病例中，PCNA阳性有40例，阴性有6例；在13例Cyclin D1阴性病例中，PCNA阳性9例，阴性4例。Cyclin D1与PCNA在恶性多形性腺瘤的表达成正相关（r=0.821，P＜0.05）。

3 讨论

越来越多的临床研究结果表明，尽管腮腺多形性腺瘤是一种良性肿瘤，但是其包膜不完整，手术后容易复发，反复发作后易于恶变，因此被认为是一种“临界瘤”[7-8]。尽管目前病因尚未完全清楚，但是研究表明细胞周期对于肿瘤的发生、发展均起到了重要的作用[9]。而PCNA、Cyclin D1都是细胞周期调节的重要的因子，这些细胞因子蛋白表达异常往往是肿瘤发生的重要原因之一。

表2 PCNA与Cyclin D1在不同临床特征的恶性多形性腺瘤组织表达情况

该次研究通过使用免疫组织化学染色的方法检测了正常腮腺组织、腮腺多形性腺瘤组织和腮腺恶性多形性腺瘤3种组织中的PCNA、Cyclin D1阳性表达情况，该次的研究结果发现，在正常腮腺组织中，PCNA、Cyclin D1的阳性表达率明显的低于腮腺多形性腺瘤组织和腮腺恶性多形性腺瘤组织，并且在良性的多形性腺瘤组织中的阳性表达率也明显的低于恶性多形性腺瘤组织（P＜0.05）。此外还针对恶性腮腺混合瘤组织的临床病理指标结合PCNA、Cyclin D1的阳性表达情况进行分析，结果发现PCNA、Cyclin D1的阳性表达率和肿瘤直径大小、肿瘤TNM分期以及是否有淋巴转移有关。研究发现，PCNA是一种核蛋白，能促进细胞DNA合成，在细胞增殖的启动上起重要作用[10]，被认为是反映细胞增殖状态的良好指标[11]，并且在多种恶性肿瘤组织如肺癌[11]、乳腺癌[12-13]、十二指肠癌[14]等组织中阳性表达率均明显的高于正常组织，因此，PCNA被认为是判断肿瘤预后的一个重要指标。该次的研究结果也发现，PCNA在肿瘤直径较大、TNM分期较晚和远处淋巴结转移的组织中的阳性表达率更高，表明PCNA的阳性表达可能与恶性腮腺混合瘤的预后密切相关。该次的研究结果和吕祥瑞等人[15]的研究结果相似。Cyclin D1主要功能激活细胞周期蛋白依赖性激酶 4（CDK4）[16]，CDK4 使成视网膜细胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，磷酸化的 Rb与E2F转录因子上解离，E2F转录因子活化，起始转录活细胞周期的基因，从而推动细胞周期由G1时期进入到S时期[17]。研究表明，在多种肿瘤中发现了Cyclin D1表达异常[18-20]。该次的研究结果中，Cyclin D1的阳性表达和肿瘤的大小、分期以及是否有淋巴结转移密切相关。

此外，还发现，Cyclin D1与PCNA在恶性多形性腺瘤的表达成正相关。表明了恶性腮腺混合瘤中CyclinD1和PCNA过表达同时存在，并且可能通过正反馈调节参与肿瘤的发生发展。

综上所述，CyclinD1、PCNA蛋白在恶性腮腺混合瘤中的阳性表达明显增加，表明其异常表达与恶性腮腺混合瘤发生可能密切相关，并可能对预测恶性腮腺混合瘤预后有重要意义。