人参总皂苷防治原发性骨质疏松

俞之胤 李晓华 隋 欣 杨 擎 石晓征 李 娜 韩 冬 于 澎 王 建

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

老年性骨质疏松为原发性骨质疏松疾病，主要临床表现为患者骨密度(BMD)低下、骨脆性增加，常见患病人群为绝经期妇女，是一种发病率高的全身性骨代谢疾病。人参为五加科草本植物〔1〕，活性成分包含蛋白、多肽、氨基酸、挥发油、多糖、微量元素及人参皂苷〔2～6〕，其中以人参皂苷为主要功效学物质基础。人参临床应用集中在抗氧化、调节心血管系统、抗肿瘤、提高机体免疫等〔7～13〕。人参皂苷可促进骨生长发育、预防骨质疏松。本研究观察人参总皂苷对大鼠体内碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白(BMP)、Smad1的调节作用，探讨人参总皂苷抗骨质疏松的治疗效果和分子作用机制。

1 材料与方法

1.1动物、药品、试剂及仪器 清洁级雌性SD大鼠，体重(200±10)g，购于长春市忆斯实验动物有限责任公司，动物生产许可证：SCXK(吉)2011-0004。人参总皂苷购于长春赛信生物科技有限公司。倍美力，雌激素类药物(购于惠氏制药有限公司)。RNA制备试剂(天根公司)，qRT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)，蛋白裂解液(北京鼎国公司)，ALP抗体(OminmAbs公司)，考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(上海美季生物)，Smad1抗体(美国Proteintech公司)，BMP抗体(美国Proteintech公司)。引物由长春百金生物公司代理合成。qRT-PCR仪(德国艾本德公司)；酶标仪(瑞士帝肯公司)。X-射线骨密度仪(美国LUNAR公司)；蛋白电泳(美国通用公司)；离心机(德国艾本德公司)；核酸提取构建仪(瑞士帝肯公司)；核酸电泳(美国伯乐公司)；恒温水浴(美国赛墨菲公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组 随机将60只雌性大鼠分为空白组、模型组、阳性组、人参总皂苷高、中、低剂量组。空白组大鼠进行假手术处理，剔除卵巢周围脂肪组织，其余组大鼠均进行双侧卵巢摘除手术(OVX)，建立原发性骨质疏松大鼠模型，手术后给予1 w的青霉素治疗。

1.2.2给药 采用灌胃给药方式，人参总皂苷低、中、高剂量组给药量分别为20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg，阳性组给药量为0.05 mg/kg倍美力，其余组给予等体积的生理盐水。90 d后，脱臼处死所有动物，留取股骨备用。

1.2.3BMD测量 利用X-射线BMD仪，检测手术前和治疗结束时各组大鼠股骨BMD，比较人参总皂苷治疗前后大鼠股骨BMD变化，观察人参总皂苷防治骨质疏松的作用效果。

1.2.4检测ALP、BMP、Smad1表达 引物设计及总RNA制备：利用NCBI检索大鼠ALP、BMP、Smad1的全长基因碱基序列，应用Primer Premier 6.0软件，设计PCR特异性引物ALP、BMP、Smad1，由长春百金生物公司提供合成服务，ALP正义链：ATGCCCTGAAACTCCAAA，反义链：TCTCCAGCCGTGTCTCCTC；BMP正义链：GGACTGCGGTCTCCTAAA，反义链：CAGCCTCAACTCAAACTCG；Smad1正义链：CACTATTGAAAACACCAGGCGGCAT，反义链：：GCTACTGTCACTAAGGCATTCGGCA；β-actin正义链：TTACTGCCCTGGCTCCTA，反义链：ACTCATCGTACTCCTGCTTG。利用磁珠法在全自动核酸构建仪中制备总RNA，样品溶于无菌水中。经10%核酸电泳检测RNA纯度，观察28 S和18 S含量，并进行质量评价；分光光度法测定RNA浓度，并将各组RNA浓度定量为50 ng/μl。然后将各组总RNA反转录成cDNA。Real-time PCR实验：在PCR反应管中，依次加入SYBR Primex、cDNA模板、上游引物和下游引物；用灭菌水补至20 μl，建立RCR反应体系。采用“两步法”PCR扩增标准程序〔14～16〕，反应体系为20 μl。扩增结束后统计CT值，应用“2-△△Ct”法观察人参总皂苷对ALP、BMP、Smad1 mRNA表达的调控作用。

1.2.5Western印迹实验 总蛋白样品的制备及定量：将储存在-80℃条件下的股骨研磨至细粉，按固液比1∶10加入组织裂解液，转移到离心管中，加入适量苯甲基磺酰氟(PMSF，100×)，冰浴裂解2 h。12 000 r/min、离心10 min，上清液为股骨总蛋白。采用考马斯亮蓝法制作蛋白标准曲线。用纯水将各组蛋白浓度定量至同一水平，进行Western印迹实验，观察人参总皂苷对ALP、BMP、Smad1蛋白表达的影响。免疫印迹法检测ALP、BMP、Smad1蛋白表达：将定量后的蛋白样品加热变性，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测。将胶片转移至三层滤纸上，加盖硝酸纤维素薄膜(PVDFC)膜，覆盖3层滤纸，固定后，转膜70～90 min。依次进行洗涤、牛奶封闭、洗涤，一抗、二抗封闭，最后进行电化学发光(ECL)法显色，在凝胶成像仪中观察各组ALP、BMP、Smad1蛋白情况。

1.3统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组BMD比较 手术前各组股骨BMD水平差异无统计学意义(P>0.05)；治疗90 d后，与空白组比较，模型组BMD显著降低(P<0.01)，证实造模成功。治疗90 d后，与模型组相比，阳性组BMD显著升高(P<0.01)，人参总皂苷高、中剂量组BMD均增加明显(P<0.05)，低剂量组也有增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各组ALP、BMP、Smad1 mRNA表达水平比较 将制备的总RNA样品进行琼脂糖电泳检测，电泳结果见图1。图中28 S和18 S条带清晰可见，经比对marker，其碱基数吻合，总RNA纯度高，经过对总RNA质量评价，基本满足荧光定量PCR实验要求。与空白组比较，模型组ALP、BMP、Smad1 mRNA表达均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性组及人参总皂苷高剂量组ALP、BMP、Smad1的mRNA表达均显著升高(P<0.01，P<0.05)，中剂量组BMP mRNA表达也显著升高(P<0.05)，且中剂量组ALP、Smad1 mRNA及低剂量组ALP、BMP、Smad1 mRNA表达有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3各组ALP、BMP、Smad1蛋白表达情况比较 与空白组比较，模型组ALP、BMP、Smad1蛋白表达均显著下降(P<0.01)，与模型组比较，阳性组、人参总皂苷高、中剂量组ALP、BMP及Smad1蛋白表达均明显升高(P<0.01，P<0.05)，低剂量组呈现升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表3。

表1 各组股骨BMD比较

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05,3)P<0.01；下表同

1～6：空白组、模型组、阳性组、高、中、低剂量组；M:marker图1 各组大鼠股骨总RNA电泳图

表2 各组ALP、BMP、Smad1 mRNA水平比较

图2 各组ALP、BMP、Smad1蛋白表达

表3 各组ALP、BMP、Smad1 蛋白相对表达量的比较

3 讨 论

BMD是目前诊断骨质疏松的重要风险标记物，且利用骨密度仪照射大鼠股骨，操作简单且数据可靠。ALP是一大类同工酶，广泛分布于骨骼中，ALP活力的变化是临床上检测各类骨骼疾病的重要指标，临床常被用作评价骨形成和骨转化的检测指标。BMP和Smad1是转化生长因子(TGF)-β信号通路的主要成员，其中BMP是一种骨成型蛋白，作为重要的细胞因子主要游离在细胞外，起调控成骨细胞分化和骨形成的作用〔17〕。通过与其受体作用后，特异复核Smad1/5/8，进而作用细胞核内的Smad4来调节骨代谢平衡〔18,19〕。所以初步猜想人参皂苷有调节骨代谢的作用，可能是通过调控BMP/Smad1信号通路来实现的。目前原发性骨质疏松临床诊疗标准明确，临床用药治疗多集中在西药及联合用药，如双磷酸盐类、钙剂、VitD或K2、降钙素、雌激素类、甲状旁腺素类、锶剂、雌激素受体调节剂〔20，21〕。研究者们〔22～24〕开展了补虚中药及复方在骨质疏松治疗中的研究，证实了多种中药或复方可能有抗骨质疏松的作用。本研究证实人参总皂苷能改善大鼠股骨BMD，同时调控ALP、BMP、Smad1 mRNA表达水平和蛋白表达水平一致。证实人参提取物在防治骨质疏松中可能发挥一定的防治作用，但具体是人参中哪种皂苷发挥作用或起主导作用，还需后期进行多种人参皂苷单体的筛选和验证。为进一步阐述人参皂苷抗骨质疏松分子作用机制，作者将利用二维电泳-质谱联合应用技术建立骨质疏松模型组和治疗组的蛋白组学分析，比较二者之间显著差异表达的蛋白，然后利用qRT-PCR技术，验证相关基因的差异表达，需找调控骨质疏松的功能蛋白。并借助功能蛋白作用的信号通路阐述人参皂苷治疗骨质疏松的作用机制。