老年抑郁症患者血浆脑源性神经营养因子水平与G196A基因多态性的相关性

王丽娜 马金芳 王秀娟 张美霞 王 娟

(新乡医学院第二附属医院精神科，河南 新乡 453002)

抑郁症为精神障碍性疾病，以显著而持久的心境低落、思维和行为异常为主要临床特征〔1〕，近年来老年抑郁症发病率逐年上升〔2，3〕。老年抑郁症病因复杂，与大脑神经递质减少、激素异常、内分泌系统变化及大脑神经纤维摄氧不足、下丘脑-垂体-肾上腺-轴功能障碍等密切相关〔4,5〕。脑源性神经营养因子(BDNF)对神经元的生长、发育、存活及突触可塑性具有重要作用，其与抑郁的发病机制可能有重要关联〔6〕。随着人类基因组计划的完成，研究发现BDNF水平、G196A基因多态性与抑郁相关〔6，7〕。但目前国内外尚缺乏关于老年抑郁症血浆BDNF水平与G196A基因多态性的相关性研究。因此，本研究探讨老年抑郁症患者血浆BDNF水平与G196A基因多态性的相关性。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2016年1月至2017年4月新乡医学院第二附属医院确诊的90例老年抑郁症患者为研究组，入选标准：符合中国精神疾病分类方案与诊断标准修订版(CCMD-2-R)抑郁症及美国精神障碍诊断手册第4版(DSM-W)抑郁障碍的诊断标准〔8〕、17 项汉密尔顿抑郁量表评分>17分〔9〕、年龄>60岁、无神经障碍及痴呆。选取同期17 项汉密尔顿抑郁量表评分<7分的60例健康体检者作为对照组，排除标准：严重躯体疾病及精神障碍、意识障碍、运动视觉或听觉异常、严重痴呆。研究组男38例、女52例，年龄61～80岁，平均(67.35±6.57)岁；对照组男23名，女37名，年龄61～77岁，平均(67.32±7.12)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象知情同意。

1.2BDNF水平的检测 分别抽取研究对象早晨空腹静脉血3 ml，放入采血管中(不加抗凝剂)，于25℃、转速3 000 r/min离心10 min，分离血浆；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆中BDNF水平，操作步骤按照BDNF试剂盒(上海拜力生物科技有限公司)说明书进行。

1.3G196A基因多态性的检测 分别抽取研究对象早晨空腹静脉血3 ml，放入采血管中(不加抗凝剂)，于25℃、3 000 r/min离心10 min，分离血清，-80℃冻存备用。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测血清中G196A基因：用Trizol试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取血清中总RNA，计算提取的RNA的纯度后，按照mRNA逆转录试剂盒(上海生工生物工程有限公司)说明书进行逆转录全成cDNA；采用Primer5.0软件设计引物，上游引物为5′ACTCTGGAGAGCGTGAAT3′，下游引物为5′ ATACTGTCACACACGCTC3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成，并经NCBI数据库同源性比对；以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系：95℃，(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s)共40个循环；72℃延伸5 min，96孔板，并设3个复孔，以重水为阴性对照。取PCR扩增产物(308 bp)，加入5 U Nia限制性内切酶(新英格兰生物实验)，置37℃水浴消化6 h后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(100 V电压电泳2 h，硝酸银染色分型)。扩增片段长度243、59、6 bp的为G/G 型，168、75、59、6 bp的为A/A 型，43、168、75、59、6 bp的为G/A 型。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0软件进行χ2和t检验、Pearson相关性分析及多元逐步回归分析。

2 结 果

2.1两组血浆BDNF水平比较 研究组血浆BDNF水平〔(10.47±3.15)μmol/L〕显著低于对照组〔(16.13±2.54)μmol/L〕(P<0.05)。

2.2两组G196A基因多态性比较 G196A基因PCR特异性扩增产物约为500 bp(图1)。当等位基因为A型时，PCR扩增产物片段长度为500 bp的1条电泳带；等位基因为G型时，PCR扩增产物片段长度为131 和369 bp的2条电泳带；等位基因为AG型时，PCR扩增产物片段长度为131、369和500 bp的3条电泳带(图2)。研究组G196A基因型分布频率、等位基因分布频率和等位基因携带分布频率与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3Pearson相关性分析及多元逐步回归分析结果 Pearson相关性分析结果显示，老年抑郁患者血浆中BDNF水平与G196A等位基因分布频率呈负相关(r=-0.674，P<0.05)。多元逐步回归分析结果显示，血浆BDNF水平与G196A等位基因多态性密切相关(P<0.01)。见表2。

表1 两组G196A基因型分布及等位基因携带的比较〔n(%)〕

A+表示AA+GA；A-表示GG；G+表示GG+GA；G-表示AA

表2 血浆BDNF水平与G196A等位基因分布频率的相关性

图1 G196A基因PCR扩增产物的电泳图

图2 G196A酶切电泳

3 讨 论

老年抑郁症发病机制复杂，可伴随有躯体生理的变化、神经细胞因缺少营养发生皱缩、脑发生萎缩，引起神经系统功能的衰退，去甲肾上腺素、多巴胺、乙酰胆碱等的分泌水平和下丘脑-垂体-肾上腺轴及下丘脑-垂体-甲状腺轴等的损伤均与老年抑郁密切相关〔10,11〕。BDNF可通过降低神经细胞对缺血状态的反应，延缓缺血后神经细胞的死亡时间，恢复缺血后神经细胞的功能，对缺血后脑神经细胞具有保护作用〔12,13〕。BDNF可穿过血脑屏障，血浆中BDNF水平可反映脑组织中BDNF含量。G196A基因是由第196位碱基鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)而形成，其影响成熟BDNF的生成，参与多种精神疾病，是学习记忆、神经元突触可塑性形成过程中的重要蛋白分子。G196A基因多态性可影响细胞内的蛋白转运和分泌，G196A等位基因频率可反映蛋白细胞的内转运和活性〔14〕。老年抑郁症患者机体功能发生了退行性改变，使体内环境中细胞因子出现了相应改变、神经细胞发生了分化凋亡，丧失了对神经细胞的再生修复及保护的作用〔15〕；G196A基因多态性的改变，改变了患者细胞内pro-BDNF的蛋白转运和分泌水平，影响成熟BDNF的生成和活性，进而影响患者神经细胞的可塑性和再生能力。BDNF通过与高亲和力的酪氨酸激酶受体结合，刺激和促进神经细胞生长分化、维持神经细胞存活和正常功能、防止神经元受损死亡，BDNF基因调控BDNF的表达水平〔16〕。BDNF分泌减少可影响患者的记忆功能及海马体积，增加抑郁症、精神分裂症等的易感性，使患者认知功能下降〔17〕。因此，血浆BDNF水平的降低、G196A基因多态性的改变、血浆中BDNF水平与G196A基因多态性密切相关，可作为老年抑郁症的生物学指标。