3种microRNAs在良性前列腺增生与前列腺癌组织中的表达及临床意义

单 刚 孙兆林 刘 军 罗光恒 石 华 胡建新 朱建国

(贵州省人民医院泌尿外科，贵州 贵阳 550002)

前列腺癌(PCa)的发病率和死亡率居我国男性恶性肿瘤第二位，早期局限性PCa根治性切除是改善预后的重要方法，血清特异性抗原(PSA)在早期筛查、诊断和随访中有重要应用价值，但仍有10%～30%患者PSA始终阴性〔1〕。肿瘤的侵袭性生长是预后较差的根本原因。细胞分子生物学特征研究发现〔2〕，各种调控肿瘤生长、增殖、迁移、分化和凋亡的基因表达异常是重要因素。微小RNA(microRNA)在真核生物体内调节约1/3基因的转录和翻译过程，影响蛋白的表达、细胞信号通路的激活等〔3〕。赵琳等〔4〕研究指出，microRNA-4286在PCa患者血清中呈高表达，可作为新型液体活检标志物。曾祥建等〔5〕研究发现，microRNA-193a-3p在PCa患者组织和血液中表达下降，可能是PCa的潜在抑制因子。刘伟等〔6〕研究证实，microRNA-27b在PCa患者组织中表达明显低于良性前列腺增生(BPH)。本研究进一步综合分析上述3种microRNAs分子在BPH与PCa组织中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 2016年6月至2017年6月贵州省人民医院诊断PCa患者50例，BPH患者50例，纳入标准：未行手术、放化疗及内分泌等治疗；手术切除或活检取得病灶组织；临床资料完善，取得知情同意权。排除标准：前列腺转移癌，合并其他原发肿瘤；存在其他影响该研究结果的因素等。PCa患者年龄43～72岁，平均(55.6±12.3)岁；血PSA水平10～40 ng/ml，平均(25.8±11.2)ng/ml；病理分型腺癌40例，腺鳞癌7例，尿路上皮癌3例；Gleason评分2～4分(高分化)10例，5～7分(中分化)25例，8～10分(低分化)15例；临床分期Ⅰ期5例，Ⅱ期20例，Ⅲ期20例，Ⅳ期5例；肿瘤最大直径0.5～3.6 cm，平均(2.2±0.9)cm。BPH患者年龄45～70岁，平均(54.8±13.2)岁。两组一般资料具有可比性(P>0.05)。

1.2研究方法 采用反转录PCR法(RT-PCR)检测组织中microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子表达水平，并分析其与PCa临床特征的关系。RT-PCR法：常规Trizol试剂提取细胞中总RNA，紫外分光光度计(美国Sigma公司)测定浓度和纯度，反转录试剂盒(美国Santa Cruz 公司)合成cDNA，上海生工有限公司根据Gene Bank序列合成引物序列，microRNA-4286：正义5′-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′，反义5′-ACAA AGATGGTCACGGTCTGCC-3′； microRNA-193a-3p：正义5′-ACTACTTCTCCCGCCGCTAC-3′，反义5′-GAAATCAAACAGAGGCCGCATG-3′; microRNA-27b：正义5′-TACCAGTGGAGGCCGACTTC-3′，反义5′-GCACAAAG CGACTGGATGAAC-3′；内参U6：正义5′-CGCGAGAA GATGACCCAGAT-3′，反义：5′-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3′。反应体系为cDNA 2 μl+上下引物各3 μl+Taq聚合酶0.5 μl+dNTPs 1 μl+MgCl23 μl+10×缓冲液5 μl+ddH2O22.5 μl，反应条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s，共30个循环，72℃ 10 min结束。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，凝胶成像分析系统紫外分光成像，数码照相行灰度值分析，结果以2-ΔΔCt法表示。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.13种microRNAs分子在BPH与PCa组织中的表达 microRNA-4286在PCa组织中明显高于BPH，而microRNA-193a-3p和-27b表达则明显降低(P<0.001)。见表1。

2.23种microRNAs分子在PCa组织中表达与肿瘤临床特征的关系 microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子在PCa组织中表达与肿瘤临床分期和Gleason评分密切相关(P<0.05)，与患者年龄、血PSA水平、病理分型和肿瘤最大直径无关(P>0.05)。见表2。

表1 3种microRNAs分子在BPH与PCa组织中的表达

表2 3种microRNAs分子在PCa组织中表达与肿瘤临床特征的关系

与Gleason评分<8分比较:1)P<0.05；与临床分期Ⅰ～Ⅱ比较：2)P<0.05

3 讨 论

MicroRNAs虽有众多，但具备共同的分子生物学特征，框架结构有相似性，都没有开放阅读框架，可以在所有真核生物基因组中发现，且不能编码蛋白质，长度相似，大小为18～22 nt，是短序列小分子RNA〔7〕。microRNA是重要的调控因子，参与细胞生长、增殖、分化、代谢及凋亡、新生血管生成、细胞侵袭、转移等行为〔8〕。本文提示，microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子可作为诊断PCa的重要分子标志物。microRNA-4286基因定位于人染色体8p23.1上，碱基序列为5′-ACCCCACUCCUGGUACC-3′。 研究显示 microRNA-4286 在黑素瘤和食管癌中高表达，与疾病预后密切相关〔9〕。microRNA-193a-3p序列为5′-AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU-3′，主要通过抑制细胞周期发挥抑癌作用。Liang等〔10〕研究证实，microRNA-193a-3p在肺癌中低表达。microRNA-27b基因定位于人染色体9q22.32上，研究发现〔11〕，其在乳腺癌和胶质瘤中呈高表达，而在结直肠癌低表达。体外研究发现〔12〕，表皮细胞生长因子和肿瘤坏死因子(TNF)-α能通过蛋白激酶B(AKT)/核因子(NF)-κB信号通路上调microRNA-27b表达。本研究结果不仅提示上述3种microRNAs可作为鉴别PCa的重要分子标志物，且临床分期越早，分化程度越高，microRNA-4286水平越低，microRNA-193a-3p和-27b水平越高；可作为疾病严重程度与临床预后的重要预测指标〔13〕。

许泼实等〔14〕研究指出，与PCa相关的癌基因有miR-184、210、370、503等，相关抑癌基因有miR-7b、23a、26a、125b、143、221等。韩泽平等〔15〕研究指出，运用生物信息学方法对PCa相关miRNAs分子调控网络进行预测，不仅能揭示各miRNAs生物学功能，还能阐明其与PCa相关的发病机制。PCa发生是一个多因素、多基因、多个阶段最终形成的极其复杂的生物学现象，目前研究集中证实了miR-21、-145、-221和-222基因表达异常与PCa的关系〔16〕。miRNA通过转录后水平与靶mRNA的3′非编码区不完全互补配对，实现对靶基因的调控。结合前列腺基因数据库中PCa相关基因，得到细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKN)1A、磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)、表皮生长因子受体(ErbB)2、MYC、肿瘤蛋白(TP)53、雌激素受体(ESR)1和B淋巴细胞瘤基因(BCL)2共7个共同靶基因与PCa密切相关〔17〕。转录因子结合靶基因调控区的转录因子结合位点，既可激活基因的表达，也可抑制基因的表达。研究发现〔18〕，CDX2可能为多个靶基因的共同转录因子，在PCa中阳性表达率较高。