PKM2、ENO1和VEGF在河湟谷地胃腺癌患者中的表达及意义

于鹏杰 张成武 燕 速 马新福 王焕丽

(青海大学附属医院肿瘤外科一(胃肠)，青海 西宁 810001)

胃癌是全球第四位最常见恶性肿瘤，其死亡率居全球癌症死亡谱的第2位〔1〕。胃腺癌是发生于中老年人的常见肿瘤，起源于胃黏膜表面的上皮，其形成与饮食、环境、幽门螺旋杆菌(Hp)感染及机体的免疫力等有关。胃腺癌形成前黏膜上皮的异型增生是其前期病变。胃癌的发病率及死亡率在欧美等国呈现下降趋势〔2〕，但是在亚洲尤其是中国的西北地区胃癌的发病率及死亡率仍然呈现较高水平。河湟谷地是指我国青藏高原达坂山与积石山之间，黄河上游与湟水河流域在青海省境内东部地区形成的肥沃三角地带，是青海省主要的农业区，前期研究显示〔1,2〕，该地区是我国胃癌高发区及高死亡率地区之一，而且胃癌的发生及发展呈现不同的生物学行为，如该地区胃癌的发生与慢性胃病背景，Hp感染率高及遗传等因素有关，具有高侵袭性；进展期胃癌以低中分化腺癌为主，易发生淋巴结转移及神经脉管侵犯等。肿瘤形成时涉及多种基因和蛋白的异常表达，并促进病变进展〔2〕。丙酮酸激酶是糖酵解过程中的限速酶，能对磷酸烯醇式丙酮酸进行催化，转变成丙酮酸，继而产生能量。丙酮酸激酶共有4种同工酶，其中丙酮酸激酶同工酶(PK)M2是重要的酶，其不仅催化作用明显，在肿瘤的进展中还具有重要的调节作用〔3〕。烯醇酶(ENO)1作为糖酵解途径的关键酶和多功能蛋白，可以促进肿瘤细胞的增殖和转移。研究显示ENO1可能对血管内皮生长因子(VEGF)有一定的调节作用〔4〕。本实验对胃腺癌中PKM2、ENO1和VEGF的表达特征进行观察，分析其意义。

1 材料和方法

1.1临床资料 2015年2月至2016年2月在青海大学附属医院确诊为胃腺癌并行根治术的患者102例为观察组，年龄35～86岁，平均(59.9±13.4)岁，其中男53例，女49例。纳入标准：①符合WHO中胃腺癌的标准及分型；②首次确诊；③患者或家属均签署知情同意书。排除标准：①术前放、化疗；②有消化系统手术史；③伴有其他器官恶性肿瘤。经病理学确诊为胃黏膜高级别上皮内瘤变的术后组织24例为对照组1，男13例，女11例，年龄37～84岁，平均(57.3±12.1)岁；病理学确诊为胃黏膜低级别上皮内瘤变的内镜咬检组织24例为对照组2，男女各12例，年龄39～79岁，平均(58.3±11.5)岁；距肿瘤边缘>5 cm的非肿瘤性胃黏膜组织24例为对照组3，男女各12例，年龄38～81岁，平均(57.5±11.5)岁。各组一般临床特征比较无明显差别(P>0.05)。

1.2PKM2、ENO1和VEGF检测方法 4组样本均常规取材、固定、脱水、包埋并切取4 μm切片。PKM2、ENO1和VEGF的试剂(浓缩液)均购自武汉博士德生物公司。三者的检测均应用免疫组化SP法，二氨基联苯胺(DAB)显色。先进行预实验，并选择染色最理想的浓度用于正式实验。正式实验均由同一技师操作，严格按实验步骤，做好质控工作。

1.3PKM2、ENO1和VEGF结果的判定 以上皮细胞的细胞质中出现淡黄、棕黄、黄褐色为阳性。着色强度评分：无着色为0分，弱着色为1分，中等程度着色为2分，强着色为3分。选择上皮细胞分布区且染色较为明显的区域进行计数，共选择5个高倍(400倍)显微镜下的视野，取平均值，以<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。以二者相乘的得分进行评价，分值范围是0～9分，以≤4分为阴性，>4分为阳性。

1.4统计学方法 应用SAS6.12统计学软件行χ2检验、t检验、线性相关分析。

2 结 果

2.1PKM2、ENO1和VEGF比较 4组PKM2、ENO1和VEGF阳性表达有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 PKM2、ENO1和VEGF阳性表达〔n(%)〕

2.2观察组中PKM2、ENO1和VEGF在不同临床病理特征中的表达 PKM2、ENO1和VEGF的表达在不同肿瘤最大径、增殖指数、淋巴结转移和TNM分期患者中有统计学差异(P<0.05)，PKM2、ENO1的表达在不同分化程度患者中有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 观察组中PKM2、ENO1和VEGF在不同临床病理特征中的表达〔n(%)〕

2.3观察组中PKM2、ENO1和VEGF的相关性 PKM2和VEGF(r=0.40，P=0.040)、ENO1和VEGF(r=0.38，P=0.049)呈正相关。其余指标间未见明显相关(P>0.05)。

3 讨 论

胃腺癌临床表现为侵袭性的生物学行为，转移率高，浸润性强，生物学行为不良，预后较差。胃腺癌间质富于血管，可以观察到肿瘤进展时血管新生。VEGF是重要血管生成促进因子，可以引起血管内皮细胞的分裂和繁殖，可以使高增殖性肿瘤缓解缺氧的状态，并提供必要的营养〔5,6〕。PKM2是新发现的肿瘤乏氧代谢标志分子，表达升高预示着细胞缺氧的状态，并为肿瘤乏氧状态下血管新生提供支持〔7〕。ENO1是F框/WD-40域蛋白(FBXW)7的靶蛋白，可以被FBXW7泛素连接酶在翻译后进行调控，而FBXW7缺失可以诱导ENO1 蛋白水平明显增加〔8〕。ENO1可以作为血管内皮细胞的氧化应激蛋白，在细胞质中起催化作用〔9〕。ENO1在生理过程中发挥作用主要是由细胞内定位和内在编码结构决定的，细胞膜中ENO1促进肿瘤细胞侵袭和转移，胞质中ENO1可促进肿瘤生长和运动。胞质中ENO1是糖酵解的关键酶〔10〕。ENO1在上皮性恶性肿瘤中表达的是癌基因样作用，即在氧充分的情况下，恶性肿瘤细胞仍有较强的糖酵解过程。而事实上在恶性肿瘤进展中糖酵解作用明显增强，作为这个途径的关键酶，ENO1存在一个跨胞质的COOH端，通过这个区域活化及稳定纤溶酶原，肿瘤细胞进行入侵和转移〔11〕。本研究提示PKM2、ENO1和VEGF是促进胃腺癌病变形成的重要因素，PKM2、ENO1诱导肿瘤形成与其对增殖的调控有关，主要与伴侣蛋白结合到PKM2结构域上并进行折叠有关。VEGF的作用可能途径更多，包括对血管生成，对增殖的调控等。本研究提示PKM2、ENO1和VEGF是促进肿瘤细胞增殖、生长和转移的重要蛋白质因素。PKM2、ENO1参与肿瘤细胞的生长过程，尤其是PKM2、ENO1高表达后，使肿瘤细胞停滞于幼稚阶段，引起肿瘤细胞的失控性增生，细胞相对原始，细胞的形态异型明显，增殖程度高并具有多向分化的潜能〔12,13〕。本研究提示PKM2、ENO1均可以通过促进VEGF表达起到明显的促进肿瘤进展的作用，即PKM2、ENO1通过介导VEGF表达发挥促进血管生成的作用。PKM2对肿瘤转移相关蛋白调节作用明显，通过诱发上皮-间质转化促进肿瘤迁移〔14〕。ENO1还可以作用于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径，也能被弗林蛋白酶激活，参与组织的生理、病理改造过程。PKM2、ENO1和VEGF是淋巴结转移的促进蛋白，这与肿瘤的高迁移性有关。由于TNM分期是与患者预后相关的重要蛋白，因此PKM2、ENO1和VEGF高表达是肿瘤进展的重要因素，同时检测PKM2、ENO1和VEGF的表达可能与患者的预后有关〔15〕。肿瘤在生长过程中可以形成间质反应，主要表现是间质的纤维化和炎细胞浸润，炎细胞浸润无特殊性，PKM2、ENO1对间质的炎细胞形成起明显的调节作用，进而与间质反应密切相关〔16,17〕。VEGF可以诱导肿瘤间质中CD34阳性的血管新生，为肿瘤旺炽性生长提供营养支持，同时也为肿瘤细胞播散提供血管通路〔18〕。PKM2在上皮间质转化中的作用，与上皮间质转化时Ras相关的C3肉毒底物(Rac)1的活化有关。也有研究认为PKM2可能通过激活基质金属蛋白酶(MMPs)起作用〔19〕。因此PKM2、ENO1对转移的调节作用途径可能更多，尚需要更多实验研究来证实。