胱抑素C、尿微量白蛋白肌酐比值与胱抑素C基因多态性老年糖尿病视网膜病变的相关性

黄秋菊 李玉兰 韦秀英 马 翔 周 玉 龙入虹 钟 萍

(柳州市人民医院内分泌科，广西 柳州 545006)

糖尿病视网膜病变(DR)是2型糖尿病(T2DM)最常见的周围神经病变相关的并发症，是造成T2DM患者视力下降、视野缺损或致盲的主要原因，T2DM患者中DR发病率为60%～90%，其中视力丧失者占8%。目前DR的发病机制尚不清楚，探索发病机制对于DR治疗具有重要意义〔1～3〕。胱抑素(Cys)-C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂，早前作为反映肾小球滤过率及肾功能的指标，近年来发现Cys-C参与心血管系统的病理过程，而且是诸多心血管事件的独立危险因素，具有较强的预测功能〔4，5〕。尿微量白蛋白肌酐比值(ACR)，尤其是首次晨尿ACR有着很好的稳定性，作为敏感指标，可较好地反映早期肾功能损伤。研究显示Cys-C基因多态性可影响外周血Cys-C表达〔6〕，因此部分患者即使存在肾功能损伤，外周血Cys-C水平并不明显增高，但也有研究表明Cys-C基因多态性与外周血Cys-C水平无关〔7〕。本课题拟考察Cys-C和ACR与DR的关系，为DR的治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 经院内伦理委员会同意，选取2011年8月至2016年8月柳州市人民医院就诊的T2DM患者126例，根据2002年国际分级标准〔8，9〕，并根据眼底病变严重程度分为A(增殖期视网膜病变33例)、B(背景期视网膜病变50例)、C(无视网膜病变组43例)3组。同期健康体检者32例为对照组。受试者均签署知情同意书。

1.2排除标准 1型糖尿病；由高血压、机械性碰撞殴打等原因引起的视网膜病变；合并严重的肝、肾、心和肺功能障碍；合并恶性肿瘤。

1.3仪器和试剂盒 810半导体激光、视野检查仪﹑日本拓普康非接触眼压仪﹑徳国ZEISS电脑验光仪﹑角膜地形扫描仪﹑超大型声波角膜测厚仪﹑角膜曲率计仪﹑裂隙灯检查仪、日本佳能数字眼底照相机CX-I，AU2700全自动生化仪检测。血糖和血脂试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Cys-C剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司；尿肌酐试剂盒购自北京院子能科学研究院。

1.4Cys-C基因检测 搜索GenBank的Cys-C基因启动子序列，用Primer软件设计引物，Cys-C基因+148、+73和-82位点引物序列见表1。聚合酶链反应(PCR)体系50 μl：混合反应液8 μl+含dNTP和Taq酶0.5 μl+DNA模版2 μl+上、下游引物各1 μl，用无菌水定容。Cys-C+148、+73和-82基因位点的扩增条件：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，62℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸5 min。将酶切产物在琼脂糖凝胶上点样，凝胶图像分析仪下观察。

表1 Cys-C+148、+73和-82基因位点引物序列

1.5血糖和血脂 检测所有受试者的空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)。

1.6其他指标 检测所有受试者血压和血清Cys-C。尿液ACR检测取晨尿的中段尿，尿微量白蛋白采用放射免疫法检测。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行χ2、F检验，Logistic多元回归分析。

2 结 果

2.1各组一般情况及相关指标的比较 各组性别、年龄、体重指数和血压差异无统计学意义(P>0.05)；病程、FBG、HbA1c、TC、Cys-C和ACR组间差异有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2 各组一般情况及相关指标的比较

2.2各组Cys-C各基因型的Cys-C和ACR水平比较 各组Cys-C各基因分型差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。各组Cys-C各基因型的Cys-C和ACR水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.3影响DR的Logistic分析 显著影响DR的因素分别为病程、Cys-C、ACR和FBG(P<0.05)，HbA1c和TC对DR影响不显著(P>0.05)，见表5。

表3 各组Cys-C各基因分型(n)

表4 各组Cys-C各基因型的Cys-C和ACR水平比较

表5 影响DR的Logistic分析结果

2.4Cys-C、ACR与DR相关性 Cys-C和ACR均与DR呈正相关(r=0.791，P=0.004；r=0.598，P=0.032)。

3 讨 论

T2DM是一种内分泌代谢性疾病，可影响全身多个器官，与眼睛的关系更为密切，DR是T2DM最严重并发症之一，DR可随DM病程加长而严重〔10，11〕。

Cys-C是低分子量的减性非糖化蛋白质，在人体内稳定表达，不受年龄、性别和肿瘤病变等因素影响〔10〕。生理状态下，Cys-C的功能在于抑制内源性半胱氨酸蛋白酶活性。近期研究显示，Cys-C基因多态性可影响Cys-C外周血的表达及活性，原因在于Cys-C+73位点的A/G突变，可诱导信号肽在位点的丙氨酸被苏氨酸所替代，Cys-C+148位点G/A突变，可诱导信号肽在位点的苏氨酸为丙氨酸所替代，上述替代影响了Cys-C向内质网及高尔基复合体输运，致使Cys-C分泌减少甚至活性降低〔12〕，但本课题结果显示，Cys-C3个基因位点+148、+73和-82在正常人和T2DM患者的分布不存在差异，不同基因型的T2DM患者Cys-C无统计学差异，类似结果也可见相关文献〔13〕。但对于检出的外周血Cys-C活性是否降低难以确认，未检出相关性是否与纳入的患者例数较少，人群代表性还不够强等受限因素相关，仍有待扩大样本后验证。Cys-C与T2DM的慢性并发症相关，与基质金属蛋白酶和组织蛋白酶协同参与T2DM的血管和神经病变过程〔14，15〕。

本课题结果提示Cys-C与DR关系密切，可能原因在于Cys-C可通过影响蛋白水解酶的活性及可抑制同型半胱氨酸的代谢，参与血管内皮细胞损伤、血管重塑、血管壁重构、血管新生及神经元退行性等病变过程相关，DR的病理具体表现为小动脉闭锁，新生血管和纤维组织不可逆增生，并伴随炎症反应增强，致使血管和神经发生不可逆损害，视力降低及不可逆的失明，可见血清Cys-C和DR具有共同病变通路是两者密切相关的病理基础〔16～20〕。由此可见血清Cys-C水平可反映并预测T2DM视网膜神经病变的程度，可作为指示DR程度的危险因素，因此在T2DM确诊后可检测Cys-C，有利于及早防治或延缓DR的发生和发展。

高血糖是ACR升高的重要病因，持续的高血糖可使肾小球处于高滤过状态，肾小球毛细血管通透性改变，毛细血管壁血浆蛋白沉积，使肾脏病变进行性发展。ACR越高，血糖的控制越差。DR的发生发展伴随肾脏滤过功能与蛋白排泄异常，促使尿微量白蛋白明显增加，尿肌酐相对降低，ACR增高，视网膜神经病变相关的氧化应激及炎症可进一步增高尿微量白蛋白，进而增加ACR〔21～23〕。ACR检测不仅方便快速，而且精确可靠，对于定性或定量DR可作为重要的参考指标。研究显示外周血清Cys-C水平与FBG、HbA1c和TC呈正相关〔24〕，本文结果显示，随着DR严重程度增加，Cys-C水平明显增加，FBG、HbA1c和TC也随之升高。