基因工程技术在甜瓜属作物分子育种中的应用与发展

段莉莉　朱拼玉　李季　陈劲枫

摘 要： 黄瓜和甜瓜均属于葫芦科甜瓜属作物，作为重要的园艺作物在全世界广泛种植。我国黄瓜和甜瓜的种植面积与产量均居世界第一。不断培育优质高抗的新品种是促进产业持续发展的重要推动力，但常规育种存在转育效率低、育种周期长等问题。多年来瓜类育种家们一直致力于甜瓜属作物基因工程育种方法的探索和研究，随着黄瓜和甜瓜在基因组研究领域取得了重大突破，大量重要功能基因的发掘与克隆为基因工程育种带来了机遇，也促使甜瓜属作物基因工程技术研究进入了快速发展的阶段。就基因工程技术在甜瓜属作物分子遗传育种研究中的应用和发展现状、存在问题以及未来发展趋势等进行了探讨。

关键词： 黄瓜； 甜瓜； 基因工程； 分子遗传

Application and development of genetic engineering technology in molecular breeding of melon crops

DUAN Lili， ZHU Pinyu， LI Ji， CHEN Jinfeng

（State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， Jiangsu， China）

Abstract： Cucumber and melon， which belong to the Cucumis family， are widely cultivated in the world as important horticultural crops. The planting areas and yields of cucumber and melon in China are the highest in the world. Continuous cultivation of new varieties with high quality and high resistance is an important impetus to promote the sustainable development of the agriculture. However， conventional breeding has many problems such as low efficiency transformation and long breeding cycle. For many years， breeders have been devoting themselves to the exploration and research on the genetic engineering breeding methods of Cucumis. Since major breakthroughs have been made in genomics research of cucumbers and melons， a large number of important functional genes have been discovered and cloned， which brings opportunities for genetic engineering breeding and prompts the development of research on the transgenic technology of Cucumis. This paper aims at exploring the application， development status， existing problems and future trends of transgenic technology in molecular genetics and breeding of Cucumis.

Key words：Cucumber； Melon； Genetic engineering； Molecular genetics

黃瓜（Cucumis sativus L.）和甜瓜（Cucumis melo L.）属于葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis），均是世界上重要的经济作物。中国是世界上黄瓜、甜瓜种植历史最为悠久、栽培面积极大的生产国。据2014年联合国粮农组织（FAO）统计数据显示，中国黄瓜和甜瓜的栽培面积约占世界种植面积的74%和36.96%，其产量与产值均居世界首位。然而在长期的农作物驯化和育种工作中，许多栽培品种的遗传变异资源已严重匮乏，同时黄瓜和甜瓜在生产上极易发生严重的病虫害。例如黄瓜霜霉病，目前已经蔓延到了80个国家，其中50个国家的黄瓜生产受到了严重影响[1-4]。蔓枯病能导致葫芦科中至少12个属23个种的作物感病，是甜瓜的主要病害，大田发病率可达20%～30%，在连作地或温室发病率高达80%[5]。同时随着社会经济的飞速发展，消费者对瓜类产品的品质要求也日益提高，因此甜瓜属作物产业的持续性发展迫切需要培育出更多优质多抗的新品种。目前基于常规育种技术的黄瓜、甜瓜新品种培育一直存在遗传基础狭窄、育种周期长甚至生殖隔离等问题[6]，无法满足当前产业飞速发展的要求。另一方面，随着黄瓜[7]和甜瓜[8]基因组测序的完成，甜瓜属作物研究已进入后基因组时代，虽然大量基因的预测与注释为甜瓜属作物育种改良奠定了重要基础，但重要农艺性状基因的功能验证与快速转育也面临着巨大的挑战。基因工程技术是实现基因在物种间快速转育的有效途径，也是基因功能验证的重要方法。自20世纪90年代，甜瓜属作物基因工程技术研究已表现出良好的发展势头，但甜瓜属作物的遗传转化技术依旧存在再生体系建立困难、转化率低、嵌合率高等方面的问题。笔者将就基因工程技术在甜瓜属作物分子遗传育种研究中的应用和发展现状、存在的问题以及未来发展趋势等进行探讨。

1 甜瓜属作物遗传转化技术发展现状

植物遗传转化方法多种多样，其中农杆菌介导法、花粉管通道法和基因枪法等成熟技术已经在甜瓜属作物遗传转化中得到了成功应用。然而再生体系建立困难、转化率低、遗传稳定性差及嵌合体等问题在甜瓜属作物转化中依然存在。多年以来，研究者尝试进一步优化现有体系，同时也在不断探索新的转化方法，例如显微注射法、电击穿孔转化法、病毒介导转化法等。

1.1 农杆菌介导法

农杆菌介导遗传转化法具有外源基因插入拷贝数低、遗传稳定性好、操作相对简单和价格低廉等优点，早在上世纪90年代就已经在甜瓜属作物中成功应用。Raharjo等[9]借助3种根癌农杆菌菌株，将水稻几丁质酶的相关基因（RCC2）转入黄瓜，通过分析证实了转基因黄瓜系中该基因的正常表达，且在后代中稳定遗传。Bordas等 [10]用农杆菌介导法将hal基因成功转入甜瓜基因组并正常转录。

高效的农杆菌介导的遗传转化体系依赖于较高的外植体再生频率。然而甜瓜属作物与拟南芥、烟草、番茄等作物相比，大多数基因型的外植体分化再生频率较低，限制了农杆菌介导转基因技术在甜瓜属作物育种及后基因组学研究中的广泛应用，因此建立高效稳定的黄瓜、甜瓜离体再生体系是亟需解决的问题。侯爱菊等[11]创建的再生体系是以‘长春密刺为基因型、子叶节为外植体，获得了较高的再生率和子叶节的利用率。但仍然存在基因型差异明显和顶部节间雄花簇生等问题。苏绍坤等[12]发现pH值较低的分化培养基有利于黄瓜子叶节的分化，pH 5.2条件下的诱芽率是pH 5.8的2倍，达到了36.7%。肖守华等[13]以厚皮甜瓜的子叶为外植体，建立了高效的甜瓜再生体系，不定芽诱导率可达92.6%，并利用农杆菌介导法将小麦γ-硫堇蛋白基因转入了甜瓜。迄今，已建立的甜瓜高效离体再生体系包括采用子叶、下胚轴以及真叶等外植体[14]。农杆菌侵染率、抗氧化剂或有机物的添加方式以及固化剂类型等同样对甜瓜属作物的农杆菌介导的遗传转化效果有着密切影响。宁宇等[15]发现适宜浓度的乙酰丁香酮（AS）可以增强农杆菌侵染黄瓜外植体的效果。王烨等[16]也发现同时添加抗氧化剂硫辛酸（LA）和乙酰丁香酮（AS）与单独使用这2种试剂相比能显著提高农杆菌的侵染效率，可使黄瓜抗性芽的诱导率由28.3%提高到86.7%。方丽等[17]发现AS并不能显著改善农杆菌侵染甜瓜外植体的效率，但在分化培养基中添加0.5 mg·L-1 Ag+时对转化率具有明显促进作用，转化率可达35.6%，远高于对照的19.6%。李建欣等[18]研究发现添加Ag+也能够极大地提高黄瓜再生芽率和芽增殖数。李蕾等[19]发现，将脱乙酰吉兰糖胶取代琼脂为培养基固化剂，并添加1.5 g·L-1水解酪蛋白可以显著提高抗性芽诱导率。恰当的抗生素选择压力是平衡抗性芽诱导率和假阳性芽形成率的关键。苏绍坤等[12]认为30 mg·L-1的卡那抗生素浓度就已经完全抑制黄瓜非抗性芽的分化。但大部分黄瓜遗传转化研究都将卡那霉素的质量浓度提高到100 mg·L-1，以降低假阳性率[15，18-19]。与黄瓜相比，甜瓜对卡那霉素耐性高，筛选浓度可高达150 mg·L-1[17]。潮霉素抗性标签也经常用于甜瓜属作物遗传转化，王学斌等[20]认为潮霉素筛選的最适浓度为6 mg·L-1。除了抗生素压力筛选外，研究者还开展了生物安全标记在甜瓜属遗传转化里的应用研究。例如基于木糖异构酶基因（XylA）构建的木糖筛选体系，已经在黄瓜遗传转化中得到了成功应用[21]。

1.2 花粉管通道法

农杆菌介导的遗传转化方法为甜瓜属作物提供了一种常规且有效的转基因途径，但依赖于高效再生体系的建立，因此在研究和优化农杆菌介导法的同时，也开展了其他转基因途径的研究。花粉管通道技术因具有操作简单、成本低等优势，被证明是一种可用于黄瓜转基因育种的有效方法[22]。目前花粉管通道法在黄瓜上的应用主要采用切柱头滴加法和子房注射法。Zhou等[23]通过该方法成功地将外源海岛棉DNA导入陆地棉基因组中，培育出了抗枯萎病的栽培新品种。目前甜瓜属作物的花粉管通道法主要采用切柱头滴加法和子房注射法。研究发现，授粉时间是甜瓜属作物花粉管通道转化法的主要影响因素。哈斯阿古拉等[24]以甜瓜品种‘河套蜜瓜为受体材料，在授粉后的不同时间段切去柱头滴加DNA溶液，其中授粉7 h后滴加 DNA溶液所获得的转化率最高，为28.3%。张文珠等[25]通过对子房涂抹、切割柱头以及子房注射这3种花粉管通道法的转化成果进行比较，证实了后2种常用技术的坐瓜率和结籽率都显著高于子房涂抹法，2者的转化率分别是 0.05%和0.11%，而子房涂抹法没有得到转基因植株。同时研究者们发现，花粉管通道技术的效果主要受到授粉后处理时间的制约。Zhang等[26]研究发现，甜瓜在授粉24 h后对授粉子房进行处理效果最好，而哈斯阿古拉等[24]认为，在甜瓜授粉后7 h对子房进行菌液注射效果最好。由于甜瓜属作物的柱头很大，使用该方法进行转化较为方便，但与此同时，转化率会受到制约，需要精确掌握授粉后的时间，同时也具有易受到环境条件的影响、整合不稳定、仅限于开花时期应用等缺点。近几年来，研究者们对于花粉管通道法在黄瓜上的应用还具有很大的争论，因为在分子水平并没有确切的证据。

1.3 基因枪法

基因枪转化法又称微弹轰击法、粒子轰击法（particle bombardment），是将载有外源DNA的钨或金颗粒加速后射入受体细胞中的一种遗传物质导入技术，是以高压气体和高压放电为转化力量来源，用微粒对植物组织进行轰击而将其上的外源基因带入到植物细胞内。Chee等[27]首次通过微粒轰击法将Nos-NPTII基因转移到黄瓜的胚性愈伤组织中，获得了107株独立再生的黄瓜植株。Kodama等[28]也利用该技术将发根基因（rol）转入黄瓜，获得了不需要外源激素就可以正常生根的转基因植株，增强了生根的效果，提高了黄瓜的逆境生存能力。基因枪转化法的优点在于可以通过工作电压的改变来精确把握粒子射入细胞的速度和深度，进而实现各类器官和组织的转化，且转化效率较高、无宿主限制、受体类型广泛、可控度高，而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也逐渐成为转基因研究中应用较为广泛的一种方法。但是此种方法成本较高、仪器昂贵，而且也要通过植物组织培养技术形成再生出植株。所以该方法在实际应用中也受到某些方面的限制，但也可以与其他转基因技术结合使用。Gonsalves等[29]使用该转基因技术与农杆菌技术，把黄瓜花叶病毒的白叶锈菌蛋白基因导入甜瓜品种中，得到了大量的转化后的四倍体或混合倍性植株，同时与非转基因植株相比较转基因植株对黄瓜花叶病毒表现出一定的抗性。目前，基因枪法在甜瓜属作物中主要用于瞬时表达和亚细胞定位。徐冉等[30]通过该技术把黄瓜α-半乳糖苷酶基因EGFP导入黄瓜愈伤组织细胞，结果显示，该基因在整个细胞中都会表达。俞婷等[31]利用基因枪法将含有荧光蛋白（GFP）标记基因的黄瓜抗白粉病基因Csa1M064780.1导入到受体细胞进行定位，结果表明，该基因位于细胞核和细胞膜上，同时也发现该基因仅在细胞膜上具有较高的表达量。

1.4 新技术方法研究

除了农杆菌介导法、花粉管通道法、基因枪法之外，近年一些新的技术也逐渐被应用于植物的遗传转化，例如显微注射法、DNA浸胚法、病毒介导的间接转化法、电击穿孔转化法、PEG介导法和基因编辑技术等。显微注射法是一种成熟的、简单的遗传转化技术，是在显微镜下通过微管向受体细胞注射外源的遗传物质。显微注射法最先是在动物细胞的遗传转化方面得到了较成功的应用，目前在动植物中都有成功应用的案例。Baskaran等[32]利用含有黄瓜花叶病毒的农杆菌菌株对茎尖分生组织（SAM）进行了显微注射，同时检测到了黄瓜花叶病毒抗性反应，说明显微注射法可以用于黄瓜的遗传转化。DNA浸胚法是指将供试的种胚浸泡在外源 DNA溶液中，利用渗透作用将外源基因导入种胚细胞中并使其稳定地整合表达与遗传。近年来，研究者通过DNA浸胚法获得了大量水稻、玉米、棉花的变异材料和品系[33]。虽然甜瓜属作物中尚未有关于DNA浸胚法的研究报道，但是在葫芦科其他瓜类作物中DNA浸胚法得到了成功应用，肖光辉等[34]利用 DNA浸胚技术把瓠瓜的遗传物质导入西瓜的基因组中，成功获得了性状产生变异的转基因植株，且在T2代中出现了许多新的表型，例如果实外观、种子形态及颜色等。病毒介导的间接转化法、电击穿孔转化法和PEG介导法等在水稻、小麦、玉米等[35-37]作物中获得了成功应用。虽然这些遗传转化方法在甜瓜属作物中尚未有研究，但为今后甜瓜属作物高效遗传转化体系的建立提供了更多途径。基因编辑技术是近年来发展起来的，可以对基因组完成精确修饰的一种技术。该技术具有快速制造新的转基因模型等优点，已逐渐在甜瓜属作物中得到了成功的应用。其中CRISPR/CAS9技术试验设计简单，在推动生物基因改造等领域发挥了重要作用[38]。刘华威等[39]认为高效稳定的CRISPR技术将与二代测序技术相结合，在甜瓜属作物对黄瓜绿斑驳花叶病毒病（CGMMV）的控制和防御方面具有广阔的应用前景，并有可能得到有效、甚至是彻底的控制。王雪等[40]利用CRISPR/CAS9系统将甜瓜品种‘老汉瓜ACC合成酶基因成功敲除，改善了该品种的耐贮运性。

2 甜瓜属作物基因工程育种现状

自20世纪90年代开始，育种家便开始利用基因工程技术针对甜瓜属作物的品质、抗性和丰产性开展了遗传改良研究。

2.1 品质改良

果实品质包括外观品质和风味品质，其中风味品质一直是甜瓜属作物育种研究的重点。陈秀蕙等[41]应用花粉管通道法在黄瓜自花授粉后直接导入菠萝的总DNA，获得的转化植株虽然在外部形态上没有明显的变化，但在含糖量等性状上存在不同程度的差异。Szwacka等[42]通过转基因技术将非洲竹芋的甜蛋白基因thaumati转入黄瓜基因组中，结果显示，转化后的黄瓜果实甜味增加，并且随着该基因表达量的不断增加，果实中的甜味也渐渐增强。

甜瓜转基因育种研究关注较多的是含糖量和耐贮运品质。李晓荣[43]用农杆菌介导法将 ACC脱氨酶基因导入新疆哈密瓜的2个品种‘皇后和‘卡拉克塞（伽师瓜），乙烯测定结果初步证明转基因植株对乙烯的生成有抑制作用，因此延长了转基因甜瓜的贮藏期。樊继德等[44]用子房注射法将甜瓜反义酸性转化酶基因导入厚皮甜瓜自交系‘01-3果实中，T1代转基因植株果实的可溶性总糖含量和蔗糖含量显著提高，但是果糖和葡萄糖含量略有降低，酸性转化酶活性比对照明显降低。Hao等[45]利用花粉管通道法将反义ACC氧化酶构建载体转入甜瓜，将转基因果实与非转基因果实在室温下贮存12 d后的表型做对比，结果显示反义ACC氧化酶转基因果实的表型明显强于非转基因果实。

2.2 抗性改良

2.2.1 抗病性改良 日益严重的病虫害成为甜瓜属作物生产中面临的重要问题，发掘并利用优异的抗病基因成为今后甜瓜属作物育种研究的重要内容。转基因技术不但可以高效地将同种内的抗病基因导入目标作物，而且可以打破生殖隔离，有效利用种属间优异抗病基因。Gonsalves等[29]将黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因成功导入甜瓜，观察到转基因甜瓜对黄瓜花叶病毒病具有一定的抗性。邓立平等[46]采用花粉管通道法，将抗霜霉病基因导入黄瓜，获得了霜霉病病情指数较对照降低15%～25%的稳定突变新品系‘CJ90-40。何铁海等[47]将CMV-CP基因转入黄瓜基因组成功获得了转基因抗病植株。Galon等[48]把可能与黄瓜果实斑驳花叶病毒相关的遗传片段转入黄瓜，增加了转化株系的相关抗性。田花丽[49]将银杏抗菌蛋白基因Ginkbilobin-2（Gk-2）通过农杆菌介导法转入黄瓜基因组中，转基因植株对黄瓜枯萎病具有较好的抗病性，可明显推迟黄瓜枯萎病的发生。

2.2.2 抗逆性改良 黄瓜已成为我国保护地栽培的第一大作物，耐低温弱光、耐热、耐冷、耐盐渍化的品种选育显得尤为重要。Ohkawa等[50]把与抗坏血酸氧化酶具有相关性的基因通过转基因技术导入黄瓜中，经研究发现，得到了较为抗寒的新的黄瓜转化品系。东丽等[51]利用农杆菌介导法将DREB1A基因转入黄瓜，提高了T1代转基因黄瓜植株的抗旱性。谭克等[52]克隆并利用花粉管通道法将与耐寒性相关的CBF1基因导入黄瓜中，获得的转基因植株对低温的忍受能力明显比对照好，并且在胁迫期间幼苗含水量和可溶性糖含量均比对照高。卢淑雯等[53]将抗寒相关基因 BnCS（YD646240）通过农桿菌 EHA105转入黄瓜，T0种子的发芽势、发芽率及胚根长均显著高于非转基因种子，T1植株的电解质渗漏率和丙二醛含量也显著低于非转基因植株，株高、茎粗和叶面积的生长量均高于非转基因植株，进而证明了转基因植株耐低温能力明显强于非转基因植株。

2.3 丰产性改良

黄瓜和甜瓜均是重要的世界性蔬菜作物，所以提高产量一直是其育种的重要目标。雌性强、低雌花节位、高坐果率以及产量均是黄瓜和甜瓜高产、稳产的基础。目前，已明确黄瓜花的性别分化除了受主控基因影响外，还受多种因素的制约，其中内源乙烯是重要影响因素之一。Shiber等[54]利用农杆菌介导法将CsACS1/G 基因导入以子叶节为外植体的雌性系黄瓜基因组中，研究发现转基因植株由全雌株变成了雌雄同株，该研究也为黄瓜植株的性别转化提供了新思路。目前我国甜瓜属作物设施栽培的主要品种普遍缺乏单性结实性，不能满足设施生产的要求。白吉刚等[55]利用根癌农杆菌把拟南芥生长素结合蛋白基因 ABP1导入‘津研4号黄瓜中，研究表明，该基因的导入明显加强了黄瓜子房对生长素的感应度，进而提高了单性结实率，增加了黄瓜的产量并为黄瓜单性结实研究增添了新的材料。

2.4 生物反应器

甜瓜属作物作为重要的瓜类作物，农药残留严重影响了果实的品质。为了加快黄瓜中残留有机磷农药的降解，赵杰宏等[56]选取能广泛降解有机磷农药的有机磷水解酶（OPH）为表达蛋白，获得的转基因植株通过酶活性分析表明，转基因黄瓜降解有机磷能力是对照组（非转基因株组）的4.7～9.7倍，为蔬菜食品安全研究提供借鉴。吴家媛[57]等将可防治龋齿的变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒（PAcA-ctxB）成功转入黄瓜，为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了研究基础。

3 甜瓜属作物重要功能基因研究进展

重要功能基因的发掘与克隆是基因工程育种的基础，明确基因的分子功能和调控机制能为育种改良提供理论指导，而转基因技术是达到上述目标的最关键途径之一。随着黄瓜和甜瓜在基因组研究中的突破和转基因技术的蓬勃发展，大量功能基因获得了克隆与研究。

3.1 黄瓜相关基因

3.1.1 苦味基因 苦味是降低黄瓜品质的重要因素之一，在生产过程中果实苦味的问题在世界各地均有发生，造成了巨大损失[58]。早在1959年，荷兰育种家Andeweg等[59]就已经从美国改良长绿品种中筛选出完全无苦味的黄瓜品系，经Balkema等[60]研究确定了苦味素或葫芦素是黄瓜苦味的起因，但其遗传机制比较复杂，除遗传因素外还和环境条件有关。顾兴芳等[61]的研究结果表明，在黄瓜基因组中，不同的器官中存在着不同的控制苦味基因，其中基因Bt调控果实而Bi调控营养器官。同时2者间也相互作用，相互影响，纯合的bibi基因对Bt基因具有隐性上位作用。同时也证实了Bi和Bi-2基因影响着营养器官中的苦味，而Bt和Bt-2基因影响着黄瓜果实中的苦味。马永硕[62]克隆并使用转基因技术把可能与Bi相关的基因Csa680导入没有苦味的黄瓜‘151G基因组中，研究发现转化植株中Csa680基因的表达量显著增加，同时转化植株中的葫芦素C含量也大量增加，进一步证实了Csa680基因就是Bi基因。控制果实苦味的Bt基因的相关研究较bi基因少，Shang等[63]发现了转录因子Bi和Bt在叶和果实中的调节通路，但目前为止尚未进行Bt基因在黄瓜中的转基因操作和功能验证。

3.1.2 果实刺瘤基因 果实是黄瓜重要经济器官，外观品质能够决定其商品价值，而果刺、果瘤的覆盖直接影响黄瓜的外观品质，进而影响其市场价格。表皮毛普遍存在于黄瓜植株地上部分的表面，在黄瓜子房或果实上的表皮毛即为果刺[64]，黄瓜的果刺和表皮毛有着相似的形态发育[65-66]。曹辰兴等[67]研究结果发现，黄瓜的刺与瘤基因（Tu）协同作用于黄瓜果实表面性状的表达。细胞核基因影响着表皮毛相关的表型，其中有毛（Gl）是显性表型，无毛（gl）是隐性，而在正常情况下，黄瓜果实表面有毛均有刺，而刺瘤的出现可有可无。有瘤性状为显性基因（Tu）控制，无瘤性状为隐性基因（tu）控制。李强等[68]通过遗传分析结果表明，无毛基因（gl）对控制果瘤性状的果瘤基因（Tu）存在隐性上位作用。杨绪勤[69]经过对基因进行定位得出了大致的结论，单基因Tu影响着黄瓜的果瘤表型，而Csa016861基因可能就是该基因的候选基因。同时经过农杆菌介导遗传转化法对Csa016861基因进行了验证，通过对转基因植株果实性状的观察，证实了该基因确实是Tu基因，同时也用试验说明了黄瓜果实的果刺和果瘤的形成密切相关。陈春花等[64]利用转基因技术，通过在黄瓜中导入基因CsTTG1和CsGL2，研究了它们对表皮毛形成的影响，结果表明，转基因黄瓜果实表面的果刺和表皮毛明显增多，果刺的体积也显著增大，而商品瓜的刺瘤性状更显著。

3.1.3 黄瓜糖转运蛋白调控基因 花粉管伸长时的高代谢活动需要高效的糖运输来支持，运输失败会导致雄性不育。蔗糖转运蛋白现已被证明在花粉管发育中起重要作用[70]。Cheng等[71]利用同源性分析克隆了黄瓜上的一个单糖转运蛋白基因CsHT1，通过农杆菌介导法将其转入黄瓜品种‘新泰密刺，并观察到该基因在黄瓜花粉中过表达CsHT1能提高黄瓜花粉在葡萄糖或者半乳糖培养基上的萌发率和花粉管的长度，从而影响种子的形成。

3.1.4 黄瓜叶片基因 在拟南芥中，HAN（HANABA TARANU）主要調控花器官的发育、顶端分生组织的形态和胚胎发育，而茎尖分生组织是持续产生其他器官和组织的关键，而叶片是其主要能量来源器官，叶形直接影响光合作用的效率[72]。Ding等[73]研究了HAN在黄瓜上的功能，将HAN的同源基因CsHAN1转入黄瓜，在转基因植株中发现CsHAN1主要在茎尖分生组织和茎的连接处表达，且该基因过表达和RNAi导致胚胎发生后早期延缓生长并且叶缘产生深裂；此外还发现，CsHAN1基因可以通过调控WUS和STM途径而调控茎尖分生组织发育、黄瓜顶端分生组织的发育，以及通过复杂的基因调控网络来调控黄瓜叶片的发育。这些结果不仅丰富了黄瓜基因的功能研究也为培育优良株型的黄瓜新品种提供了理论指导。

3.2 甜瓜相关基因研究

甜瓜是全球10大水果之一，但甜瓜生产除了病虫害危害外，果实的不耐贮运、货架期相对较短，在运输和销售过程中伴随着果实的成熟和软化，损失加剧，这些均严重影响了甜瓜的品质和外观性状，制约了甜瓜的商业化发展。

3.2.1 乙烯合成基因 甜瓜是呼吸跃变型植物，乙烯对其果实的成熟和衰老起着重要作用，也影响着果实成熟及采后贮藏性。在1996年Ayub等[74]就已经将反义ACC氧化酶基因转入甜瓜，产生了耐贮藏和品质较好的转基因甜瓜株系。目前己确定果肉颜色的发育为乙稀不依赖型，而果实发育过程中的果皮颜色受乙稀合成的影响，其中控制绿果肉（green flesh colour，gfc）和白果肉（white flesh colour，wfc）的基因是一对质量性状基因，而控制橙果肉（orange flesh colour，ofc）的为数量性状基因[75]。高峰等[76]研究发现，Cm-ERF1、Cm-ERF2基因可能在甜瓜果实乙烯跃变过程中具有重要作用，而Cm-EIN2和Cm-CTR1可能在甜瓜果实发育过程中发挥重要作用。同时也将反义ACO1基因转入甜瓜，在可溶性固形物含量不变的情况下，获得了乙烯含量低、贮藏期长且果实硬度不变的转基因甜瓜株系。马勇[77]在Hao等[45]的研究基础之上对果实发育相关的4个基因家族进行功能研究，并对CmERFII-9基因在甜瓜果实中的成熟期进行了研究观察，进一步证实了该基因在甜瓜果实发育成熟过程中对ACO基因发挥正调控作用。

3.2.2 蔗糖合成基因 含糖量是衡量甜瓜品质的主要依据之一，是影響果实品质及风味物质的主要成分。蔗糖合成酶在蔗糖代谢中调控可逆反应，闻小霞[78]克隆了甜瓜果实蔗糖合成酶基因CmSS1，并构建了该基因的反义表达载体进行了遗传转化，研究发现，CmSS1在甜瓜果实发育不同时期中，随着果实发育时间的延长，CmSS1的表达量逐渐降低。蔗糖磷酸合成酶（SPS）对光合产物在蔗糖和淀粉之间的分配具有重要的调控作用，也可能会改变蔗糖的代谢模式，另外SPS 还参与了植物的光合作用。因此，利用现代分子生物学的方法改变蔗糖代谢酶的活性对甜瓜品质育种具有重要意义。田红梅[79]研究了转入反义SPS基因和正义SPS基因的甜瓜株系，证明了SPS活性的高低是蔗糖积累的关键因素和必要前提，SPS活性升高会促进碳水化合物向蔗糖方向合成，而抑制淀粉的积累。

3.2.3 霜霉病相关基因 霜霉病是甜瓜主要病害，可造成甜瓜植株枯萎、死亡，很大程度上降低了甜瓜产量和品质，严重制约甜瓜产业健康、快速发展。在国内已知的抗霜霉病基因有Pc-1、Pc-2、Pc-3、Pc-4和Pc-5，但这些基因均没有进行功能验证。目前对霜霉病研究较多的是At2基因，它是参与植物光呼吸代谢过程中转氨酶反应的一种抗性酶，可直接反映转基因甜瓜对霜霉病的抗性[80]。Taler等[81]研究发现At1和At2这2个都不属于任何一种已知的抗病基因的因酶赋予植物的抗性基因，他们提出一种新的抗病机制“酶抗性”。聂祥祥[82]构建了含霜霉病抗性基因At2的双 T-DNA表达载体转化甜瓜，进行霜霉病活力检测，发现At2基因确实能够改善甜瓜对病原菌的抗性，同时猜测对其他的病原菌也具有一定的抗性。李思怡[83]利用转基因技术对甜瓜抗霜霉病基因At2进行了研究分析，获得了抗霜霉病的转基因植株，提高了甜瓜对霜霉病的抵抗能力。

4 问题与展望

随着研究的不断深入，转基因技术在甜瓜属作物遗传育种和基因功能研究等多个领域都得到了广泛应用，带来了巨大的经济效益和社会效益，推动了甜瓜属生物产业和生物经济的发展，但依然面临着许多问题与挑战，再生体系的基因型效应、偏低的遗传转化率、转基因安全等依旧是阻碍甜瓜属转基因技术进一步发展的重要问题。为解决基因工程技术在甜瓜属作物分子遗传育种中的瓶颈，更加准确地鉴定甜瓜属作物的优良农艺性状，使转基因技术在甜瓜属作物中得到更为广泛的利用，多系统联合使用将成为重要途径。

参考文献

[1] ALE? LEBEDA，YIGAL COHEN.Cucurbit downy mildew （Pseudoperonospora cubensis）—biology，ecology， epidemiology，host-pathogen interaction and control[J].European Journal of Plant Pathology，2010， 129（2）：157-192.

[2] COLUCCI S J，WEHNER T C，HOLMES G J.The downy mildew epidemic of 2004 and 2005 in the Eastern United States[J]. Cucurbitaceae 2006， Asheville， North Carolina， USA， 17-21 September 2006， 2006： 403-411.

[3] PANG X，ZHOU X，WAN H，et al.QTL mapping of downy mildew resistance in an introgression line derived from interspecific hybridization between cucumber and cucumis hystrix[J].Journal of Phytopathology，2013，161（7-8）：536–543.

[4] 黄仲生.保护地黄瓜霜霉病发生与防治新技术研究[J].吉林蔬菜，1995（2）：14-15.

[5] WOLUKAU J N， ZHOU X H， LI Y， et al. Resistance to gummy stem blight in melon （Cucumis melo L.） germplasm and inheritance of resistance from plant introductions 157076，420145，and 323498[J]. Hortscience A Publication of the American Society for Horticultural Science，2007，42（2）：215-221.

[6] 钱春桃，娄群峰，陈劲枫.我国甜瓜属蔬菜作物特异基因资源的挖掘和利用[J].中国蔬菜，2006，1（7）：30-32.

[7] HUANG S，LI R，ZHANG Z，et al.The genome of the cucumber，Cucumis sativus L.[J].Nature Genetics，2009，41（12）：1275.

[8] GARCIAMAS J，BENJAK A，SANSEVERINO W，et al.The genome of melon（Cucumis melo L.）[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（29）：11872.

[9] RAHARJO S H，HERNANDEZ M O，ZHANG Y Y，et al.Transformation of pickling cucumber with chitinase-encoding genes using Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell Reports，1996，15（8）：591-6.

[10] BORDAS M，MONTESINOS C，DABAUZA M，et al.Transfer of the yeast salt tolerance gene HAL1 to Cucumis melo L. cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance[J].Transgenic Research，1997，6（1）：41-50.

[11] 侯愛菊，朱延明，杨爱馥，等.诱导黄瓜直接器官发生主要影响因素的研究[J].园艺学报，2003，30（1）：101-103.

[12] 苏绍坤，刘宏宇，秦智伟.农杆菌介导iaaM基因黄瓜遗传转化体系的建立[J].东北农业大学学报，2006，37（3）：289-293.

[13] 肖守华，乔卫华，张岳民，等.农杆菌介导法将小麦γ-硫堇蛋白基因转入厚皮甜瓜[J].中国蔬菜，2008，1（12）：11-14.

[14] DIRKS R，BUGGENUM M V.In vitro plant regeneration from leaf and cotyledon explants of Cucumis melo L.[J].Plant Cell Reports，1989，7（8）：626.

[15] 宁宇，李蕾，苗永美，等.乙酰丁香酮及共培养pH对黄瓜遗传转化效率的影响[J].中国瓜菜，2013，26（5）：6-9.

[16] 王烨，顾兴芳，张圣平，等.硫辛酸对农杆菌介导的黄瓜子叶节遗传转化的影响[J].华北农学报，2012，27（b12）：51-56.

[17] 方丽，任海英，茹水江，等.根癌农杆菌介导的甜瓜遗传转化[J]. 浙江农业学报，2009，21（3）：211-214.

[18] 李建欣，李建吾，葛桂民.黄瓜子叶离体再生体系研究[J].长江蔬菜，2008（1）：44-47.

[19] 李蕾，孟永娇，张璐， 等.黄瓜遗传转化体系优化的研究[J].华北农学报，2015，30（5）：115-121.

[20] 王学斌，司龙亭，孟茜，等.潮霉素浓度和农杆菌浸泡时间对黄瓜外植体再生的影响[J].沈阳农业大学学报，2013，44（2）：143-147.

[21] 崔丽巍.木糖筛选系统在黄瓜转化中的应用[D].长春：东北师范大学，2010.

[22] 刘方，王坤波，宋国立，等.花粉管通道法转基因棉花材料的获得[J]. 中国棉花，2008，35（8）：16.

[23] ZHOU G Y.Introduction of exogenous DNA into plants after pollination via the pollen tube pathway[M].Angiosperm Pollen and Ovules.Springer New York，1992：336-339.

[24] 哈斯阿古拉，牛一丁，张丽，等.花粉管通道法转基因技术在甜瓜品种河套蜜瓜上的应用[J].内蒙古大学学报（自然版），2007，38（4）：419-423.

[25] 张文珠，魏爱民，杜胜利，等.黄瓜农杆菌介导法与花粉管通道法转基因技术[J].西北农业学报，2009，18（1）：217-220.

[26] ZHANG H J，LUAN F S.Transformation of the CmACS-7 gene into melon （Cucumis melo L.） using the pollen-tube pathway[J].Genetics & Molecular Research，2016，15（3）：15038067.

[27] CHEE P P，SLIGHTOM J L.Transformation of cucumber tissues by microprojectile bombardment：identification of plants containing functional and non-functional transferred genes[J].Gene，1992，118（2）：255-260.

[28] KODAMA H，IRIFUNE K， KAMADA H，et al.Transgenic roots produced by introducing Ri-rol genes into cucumber cotyledons by particle bombardment[J].Transgenic Research，1993，2（2）：147-152.

[29] GONSALVES C，XUE B，YEPES M，et al.Transferring cucumber mosaic virus-white leaf strain coat protein gene into Cucumis melo L. and evaluating transgenic plants for protection against infections[J].Journal of the American Society for Horticultural Science American Society for Horticultural Science，1994，119（2）：345-355.

[30] 徐冉，汤雪燕，缪旻珉，等.黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ的亚细胞定位[J].江苏农业科学，2010（6）：208-210.

[31] 俞婷，许学文，施阳，等.基于SNP标记的黄瓜抗白粉病染色体片段代换系鉴定及抗病基因功能分析[C]//中国园艺学会黄瓜分会年会，2015.

[32] BASKARAN P，SO?S V，BAL?ZS E，et al.Shoot apical meristem injection：A novel and efficient method to obtain transformed cucumber plants[J].South African Journal of Botany，2016，103：210-215.

[33] 韩伟，刘娥娥，王亚琴，等.瓜类蔬菜转基因研究进展[J].中国蔬菜，2010（4）：8-13.

[34] 肖光辉，郑素秋.外源DNA导入创造抗枯萎病西瓜种质资源[J].湖南农业大学学报（自然科学版），1999，25（6）：453-457.

[35] 肖小君，王辉，齐泽民，等.转基因技术及其在水稻育种中的研究进展[J].井冈山大学学报（自然科学版），2011，32（5）：60-65.

[36] 叶兴国，陈明，杜丽璞，等.小麦转基因方法及其评述[J].遗传，2011，33（5）：422-430.

[37] 陈英，曹毅，蒋彦，等.转基因玉米的遗传转化方法研究[J].草业与畜牧，2000（1）：51-55.

[38] 姚祝平，程远，万红建，等.CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用[J].分子植物育种，2017（7）：2647-2655.

[39] 刘华威，罗来鑫，朱春雨，等.黄瓜绿斑驳花叶病毒病防治研究进展[J].植物保护，2016，42（6）：29-37.

[40] 王雪，李冠.CRISPR-Cas9系统敲除甜瓜ACC合成酶基因表达载体的构建[J].北方园艺，2017（12）：114-118.

[41] 陈秀蕙，何焕新，曾辉.菠萝DNA导入黄瓜的初步研究[J].海南大学学报（自然科学版），1998（1）：62-68.

[42] SZWACKA M，KRZYMOWSKA M，MALEPSZY S.Thaumatin expression in transgenic cucumber plants[M].Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century.Springer Netherlands，1999：609-612.

[43] 李晓荣.新疆哈密瓜转ACC脱氨酶基因的研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2002.

[44] 樊继德，何启伟，王秀峰，等.甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化[J].园艺学报，2007，34（3）：677-682.

[45] HAO J，NIU Y，YANG B，et al.Transformation of a marker-free and vector-free antisense ACC oxidase gene cassette into melon via the pollen-tube pathway[J].Biotechnology Letters，2011，33（1）：55-61.

[46] 邓立平，郭亚华，杨晓辉.外源基因导入黄瓜获得突变新品系[J].遗传，1995，17（2）：33.

[47] 何铁海，应成波，钱剑锐，等.抗CMV病毒外壳蛋白CP基因导入黄瓜的研究[J].河南科技学院学报（自然科学版），2001，29（3）：27-28.

[48] GALON A，WOLF D，ANTIGNUS Y，et al.Transgenic cucumbers harboring the 54-kDa putative gene of cucumber fruit mottle mosaic tobamovirus are highly resistant to viral infection and protect non-transgenic scions from soil infection[J].Transgenic Research，2005，14（1）：81-93.

[49] 田花丽.农杆菌介导银杏抗菌蛋白基因Gk-2转化黄瓜抗病性研究[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2010.

[50] OHKAWA J，OHYA T，ITO T，et al.Structure of the genomic DNA encoding cucumber ascorbate oxidase and its expression in transgenic plants[J].Plant Cell Reports，1994，13（9）：481-488.

[51] 东丽，李杰，朱延明.抗真菌、抗渗透胁迫基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化的研究[J].农业科技通讯，2008（3）：37-41.

[52] 谭克，赵福顺，吴慧杰，等.冷诱导基因转錄因子CBF1转入黄瓜的研究[J].北方园艺，2015（9）：79-82.

[53] 卢淑雯，刘文萍，李柱刚，等.黄瓜耐低温基因转化后代的生物学鉴定[J].中国蔬菜，2010（10）：16-19.

[54] SHIBER A，GAUR R K，RIMONKNOPF R，et al.The origin and mode of function of the female locus in cucumber[C]//Ixth Eucarpia Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae，Avignon，2008：263-272.

[55] 白吉刚，王秀娟，尹谦逊，等.生长素结合蛋白基因转化黄瓜的研究[J].中国农业科学，2004，37（2）：263-267.

[56] 赵杰宏，韩洁，赵德刚.转基因表达有机磷水解酶（OPH）提高黄瓜降解蝇毒磷能力的初步研究[J].江苏农业学报，2010，26（1）：182-186.

[57] 吴家媛，刘建国，马欣荣，等.变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定[J].口腔医学研究，2016（9）：902-906.

[58] 张圣平，苗晗，程周超，等.黄瓜果实苦味（Bt）基因的插入缺失（Indel）标记[J] .农业生物技术学报，2011，19（4）：649-653.

[59] ANDEWEG J M，BRUYN J W D.Breeding of non-bitter cucumbers[J].Euphytica，1959，8（1）：13-20.

[60] BALKEMA-BOOMSTRA A G，ZIJLSTRA S，VERSTAPPEN F W，et al.Role of cucurbitacin C in resistance to spider mite（Tetranychus urticae）in cucumber（Cucumis sativus L.）[J].Journal of Chemical Ecology，2003，29（1）：225-235.

[61] 顾兴芳，张圣平，国艳梅，等.黄瓜苦味遗传分析[J].园艺学报，2004，31（5）：613-616.

[62] 馬永硕.黄瓜营养体苦味基因Bi的克隆及功能解析[D].南京：南京农业大学，2013.

[63] SHANG Y，MA Y，ZHOU Y，et al.Biosynthesis，regulation，and domestication of bitterness in cucumber[J].Science，2014，346（6213）：1084-1088.

[64] 陈春花.黄瓜表皮毛发育及其相关基因CsTTG1和CsGL2的功能分析[D].北京：中国农业大学，2016.

[65] 关媛.黄瓜果刺形成相关基因的定位与克隆[D].上海：上海交通大学，2008.

[66] 张驰.黄瓜Gl基因连锁的SRAP分子标记[D].上海：上海交通大学，2009.

[67] 曹辰兴，张松，郭红芸.黄瓜茎叶无毛性状与果实瘤刺性状的遗传关系[J]. 园艺学报，2001，28（6）：565-566.

[68] 李强.黄瓜表皮毛相关基因的定位、同源克隆与功能研究[D].山东泰安：山东农业大学，2013.

[69] 杨绪勤.黄瓜果瘤和果实无光泽性状基因的定位与功能分析[D].上海：上海交通大学，2014.

[70] GOETE M，GODT D E，GUIVARC'H A，et al.Induction of male sterility in plants by metabolic engineering of the carbohydrate supply[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（11）：6522-6527.

[71] CHENG J，WANG Z，YAO F，et al.Down-regulating CsHT1，a cucumber pollen-specific hexose transporter，inhibits pollen germination，tube growth，and seed development[J].Plant Physiology，2015，168（2）：635-47.

[72] TSUKAYA H.Mechanism of leaf-shape determination[J].Annual Review of Plant Biology，2006，57（1）：477.

[73] DING L，YAN S，JIANG L，et al.HANABA TARANU regulates the shoot apical meristem and leaf development in cucumber（Cucumis sativus L.）[J].Journal of Experimental Botany，2015，66（22）：7075-7087.

[74] AYUB R，GUIS M，AMOR M B，et al.Expression of ACC oxidase antisense gene inhibits ripening of cantaloupe melon fruits[J].Nature Biotechnology，1996，14（7）：862-866.

[75] MONFORTE A J，OLIVER M，GONZALO M J，et al.Identification of quantitative trait loci involved in fruit quality traits in melon（Cucumis melo L.）[J].Theoretical & Applied Genetics，2004，108（4）：750-758.

[76] 高峰，怡荣，郝金凤，等.甜瓜乙烯应答因子基因在果实发育成熟过程中的表达特性[J].西北植物学报，2012，32（5）：886-889.

[77] 马勇. 甜瓜果实发育相关四个基因家族的全基因组分析及CmERFII-9基因的功能研究[D].内蒙古呼和浩特：内蒙古大学，2015.

[78] 闻小霞.甜瓜果实蔗糖合成酶基因（SS）的克隆、表达分析及遗传转化[D].山东泰安：山东农业大学，2010.

[79] 田红梅.甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因的功能鉴定与分析[D].山东泰安：山东农业大学，2011.

[80] GALPERIN M，PATLIS L，OVADIA A，et al.A melon genotype with superior competence for regeneration and transformation[J].Plant Breeding，2003，122（1）：66-69.

[81] Taler D，Galperin M，Benjamin I，et al.Plant eR genes that encode photorespiratory enzymes confer resistance against disease[J].Plant Cell，2004，16（1）：172-184.

[82] 聂祥祥.甜瓜抗霜霉病无选择标记基因的转化和功能验证[D]. 乌鲁木齐：新疆大学，2014.

[83] 李思怡. 甜瓜抗霜霉病基因AT2功能验证[D]. 乌鲁木齐：新疆大学，2016.