高效液相色谱法分析2,6-二氨基-3,5-二硝基吡啶-1-氧化物的纯度

张蒙蒙，张 林，王友兵，周杰文，李 媛

(1.西安近代化学研究所，陕西 西安 710065； 2.空军驻西北地区军事代表室，陕西 西安 710043)

引 言

随着人们对弹药安全性能的重视，各国在高能低易损弹药研究方面投入了大量人力和物力。高能量低感度炸药是低易损弹药研究的物质基础和关键。2,6-二氨基-3,5-二硝基吡啶-1-氧化物(ANPyO)是一种新型高能低感炸药，自合成报道以来得到了广泛关注，在混合炸药、共晶共混材料方面具有潜在的应用价值[1-4]。

目前，ANPyO的研究主要集中在合成工艺[5-6]、精制方法[8-9]、金属配合物[10]、混晶[4]及热分解性能[11]等基础研究方面，应用研究也逐步开展[12-13]。含能材料性能与化合物纯度关系密切，ANPyO的纯度分析对其应用性能具有重要影响。周心龙等[9]提出了以甲醇为流动相的液相色谱分析法，由于ANPyO难以溶解于甲醇，该方法存在以下不足：一方面样品在用甲醇配置溶液时不能全部溶解于溶剂，测试结果与实际情况存在误差；另一方面色谱谱图峰型较低，影响测试结果的精度。张蒙蒙等[8]曾报道了一种利用核磁氢谱仪测试ANPyO纯度的方法，但该法默认样品中仅含ANPyO与杂质ANPy，且核磁氢谱法测试化合物纯度并未得到广泛认可。

液相色谱法测试含能化合物纯度的方法已经获得广泛应用[14-16], 由于ANPyO难溶于常见有机溶剂，常规液相色谱法测量其纯度存在困难。而纯度分析是ANPyO深入研究的基础，随着相关应用研究的推进，获得准确高效ANPyO纯度的分析方法显得更加迫切。本研究采用可微溶ANPyO的二甲基亚砜(DMSO)作为样品溶剂，利用自行建立的高效液相分析方法开展了ANPyO纯度分析，建立了纯度分析方法，可为其质量控制提供参考。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

ANPyO、ANPy，均为自制；二甲基亚砜、乙腈、甲醇，均为色谱纯，美国Fisher公司；实验用水为二次纯水，并经0.45μm滤膜过滤。

LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津株式会社；CQ-300AD超声仪，上海跃进医疗器械有限公司；BSA224S分析天平，赛多利斯(北京)有限公司。

1.2 色谱条件

反相色谱柱：InertSustain C18柱(5μm， 4.6mm×250mm)；流动相：甲醇与水的体积比为40∶60；流速1mL/min；检测波长315nm；柱温为30℃；进样量为10μL。

1.3 实验过程

分别称取ANPyO标样0.0025、0.0050、0.0100、0.0150、0.0200、0.0250g(精确至0.0002g)置于50mL容量瓶中，用二甲基亚砜溶解后稀释至标线，震荡均匀，获得质量浓度为20、50、100、200、300、400、500mg/L的ANPyO溶液，作为标准测试溶液。在上述色谱条件下进行测定，每个质量浓度的标准溶液平行进样3次，记录色谱峰高，分别取3次平行结果的算术平均值作为最终结果。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长的选择

为获得较佳的液相色谱检测波长，用HPLC自带二极管阵列，对ANPyO及ANPy样品吸光度进行测量。ANPyO及ANPy的分子结构如图1所示；其对应的紫外吸收图谱如图2所示。

图1 ANPyO及ANPy的分子结构Fig.1 Molecular structures of ANPyO and ANPy

图2 ANPyO及ANPy的紫外光谱Fig.2 Ultraviolet scanning spectra of ANPyO and ANPy

由图2可知，ANPyO最大吸收波长为315nm；ANPy有多个吸收峰，最大吸收波长为398nm。由于检测的主要成分是ANPyO，同时在315nm处ANPy有可观的吸收峰值，选择315nm为检测波长。

2.1.2 流动相的选择

反相液相色谱常用溶剂为乙腈、甲醇、水。本研究分别用乙腈/水、甲醇/水两组混合溶剂为流动相，开展了流动相筛选研究。首先选择乙腈/水为流动相，并通过调节其比例开展ANPyO样品的液相色谱分析，如图3(a)所示。

由图3(a)可知，当乙腈体积分数低至40%时，ANPyO主峰存在拖尾，且各组分仍不能彻底分开。在此色谱条件下对甲醇/水体系进行尝试，结果如图3(b)所示，ANPyO主峰虽有拖尾，各单组分可分离。分析认为，ANPyO分子内相邻的—NO2、—NH2、—N—O形成分子内氢键，相比于ANPy，其分子中所有的氨基氢原子参与形成了分子内氢键，其与色谱柱的作用力小于ANPy，因此在流动相的作用下ANPyO先于ANPy流出。两者由于结构相似度高，在分离过程中往往存在流出峰重叠的情况，因此流动相的选择显得尤为重要。据文献[17]报道，甲醇极性参数为6.6，乙腈为6.2，在反相色谱柱中，极性越强，对溶质的洗脱能力越弱，出峰越晚，极性略强的甲醇中溶质出峰稍晚，在出峰延迟的过程中ANPyO与ANPy实现了分离。因此，选择甲醇/水为ANPyO液相色谱分析的流动相进一步优化。

图3 不同流动相的ANPyO色谱谱图Fig.3 HPLC spectra of ANPyO with different mobile phases

2.1.3 样品溶剂的选择

由于样品ANPyO在乙腈和甲醇中的溶解度较小，一方面不便于样品溶剂的制备，另一方面导致出峰信号过低，对检测结果造成不利影响。本研究采用强极性溶剂DMSO对ANPyO进行溶解，将制备得到的ANPyO溶液滴入体积分数为40%的甲醇水溶液中，静置24h未发现固体析出。同时，为了降低色谱纯DMSO对ANPyO液相色谱分析结果的影响，在以上获得的液相条件下进行了空白实验，所得谱图见图4。结果表明，在2.5～3.5min处有明显的出峰。在后期纯度分析时，通过色谱条件调整，避免待检测物与DMSO出峰重合，结果计算时需剔除DMSO的影响。

图4 DMSO的高效液相色谱图Fig.4 HPLC spectrum of DMSO

2.1.4 流动相体积比的选择

为保证样品中各组分具有较好的分离度，探索了甲醇与水体积比分别为80∶20、50∶50、40∶60、20∶80时的色谱分离情况，结果如图5所示。由图5可知，当甲醇体积分数低于50%时，ANPyO样品中各组分可分开。其中，甲醇与水体积比为80∶20时，主峰与杂质可分开，但流出时间长达15min，而体积比为50∶50时，主峰与杂质峰有部分重合。对比分析，当甲醇与水体积比为40∶60时，流出时间适宜，各组分分离较好，可作为较优流动相比例条件。

图5 不同流动相体积比的ANPyO液相色谱图Fig.5 HPLC spectra of ANPyO with different volume ratio of CH3OH/H2O in mobile phases

2.1.5 柱温度及进样量的选择

当色谱柱柱温过高时，会导致色谱柱使用寿命缩短，而温度低于环境温度则不利于色谱柱的稳定，因此，本研究选择30℃作为液相色谱柱保温温度。由于样品采用极性溶剂DMSO溶解，为降低其对设备及测试结果的影响，同时获得合适的出峰信号，进样量选择为10μL。

2.1.6 流速的选择

以甲醇与水(体积比为40∶60)为流动相、柱温为30℃时，考察了流速分别为0.5、1.0、1.5mL/min对色谱谱图的影响。结果表明，随着流速的增加，样品的保留时间明显缩短，峰面积减小。流速过大会使样品与杂质的保留时间较短且过于接近，从而造成基线分离效果不佳，另外与溶剂DMSO出峰存在部分重合，影响结果的准确性。同时流速过大会使色谱仪压力过大从而影响色谱仪的稳定性，造成分析方法的精密度下降。较低的流速使样品与杂质分离得更彻底，但却导致检测时间过长从而降低实验效率。综合考虑这两方面的因素，确定流速为1mL/min。

2.2 线性关系

采用DMSO沉降法对ANPyO精制两次，核磁氢谱法及以上条件归一化测得ANPyO纯度大于99.9%。将其制备为不同质量浓度的ANPyO的DMSO溶液，作为标准测试溶液。在以上较优条件下，每个质量浓度的样品平行进样3次，记录色谱峰高，并绘制质量浓度与液相色谱峰面积的关系图，见图6。

由图6可见，在20～500mg/L范围内，ANPyO的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，回归方程为Y=60584X+2×106，相关系数R2为0.997。

2.3 准确度及精密度

采用外标法，对同一样品进行5次平行试验验证，得到的数据如表 1所示，测试结果的偏差小于0.5%，相对标准偏差≤0.24%，表明该方法测试准确性和精密度较高。

图6 ANPyO质量浓度与色谱峰面积的标准曲线Fig.6 Standard curve of ANPyO mass concentration to corresponding chromatographic peak area

2.4 合成过程样品检测

ANPyO的合成参照文献[18]进行，当反应温度达到80℃后，分别取2、4、6h时刻反应体系中固体，经过滤洗涤干燥后分别采用核磁法[8]和外标法对样品纯度进行分析，结果如表2所示。

表2 核磁法和液相色谱法获得的样品纯度

由表2可知，核磁法和液相色谱法测得的样品纯度相当，核磁法所得纯度均略高于液相色谱法，主要是核磁法默认样品中只含有ANPyO和ANPy，而研究建立的液相色谱法测试结果包含了其他杂质，所得结果更符合实际情况。

3 结 论

(1)以二甲基亚砜为溶剂，在C18色谱柱中，甲醇与水的体积比为40∶60，液相流速1mL/min，检测波长315nm，柱温为30℃，进样量为10μL的优化条件下，建立了分析主成分2,6-二氨基-3,5-二硝基吡啶-1氧化(ANPyO)和主要杂质2,6-二氨基-3,5-二硝基吡啶(ANPy)的新的高效液相色谱分析方法。

(2)该方法具有线性范围较宽、重现性好、结果准确的优点，可用于ANPyO的纯度分析。