基础日粮添加冬虫夏草菌丝体发酵液对獭兔免疫功能的影响

曹卓洋，吕清华，谢媛，方萍，*，汪荣才，叶达丰

（1.浙江大学环境与资源学院，污染环境修复与生态健康教育部重点实验室，杭州310058；2.浙江大学环境与资源学院，浙江省亚热带土壤与

植物营养重点研究实验室，杭州310058；3.宁波绿兴农业科技有限公司，浙江慈溪315300）

獭兔是一种典型的皮用兔，既可以提供珍贵裘皮，又可以提供优质兔肉。我国是世界獭兔养殖大国，獭兔皮、肉的产量和销量居世界首位。由于幼兔免疫力较差，消化能力有限，很容易引起腹胀和腹泻，甚至死亡[1]，所以，提高幼兔免疫力是降低其死亡率的重要途径。冬虫夏草（Cordyceps sinensis）是鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属幼虫被麦角科真菌中国被毛孢（Hirsutella sinensis）寄生所形成的虫菌复合体，其营养丰富，含有10多种氨基酸、多种肽类及虫草素、甘露醇、多糖等生物活性物质，具有增强免疫力的功能[2]。由于冬虫夏草菌寄生性苛刻，其寄主蝠蛾属昆虫的生境独特，主要分布在我国青藏高原等海拔3 500～5 000 m的高寒草甸生态系统区，蝠蛾完成1个生命周期通常需要3～4年，所以冬虫夏草天然资源十分稀少[3]。目前利用冬虫夏草无性型即麦角科真菌中国被毛孢[4]或伴生菌蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali）等通过深层液体发酵培养的菌丝体产品作为天然冬虫夏草的人工替代品已广泛用于保健食品中。鉴于此，能否利用液体发酵制备的冬虫夏草菌丝体液作为獭兔饲料添加剂，以提高獭兔幼仔的免疫力，从而降低死亡率，值得探讨。为此，本文对孕期及哺乳期母兔及其仔兔进行日粮中添加冬虫夏草菌丝体发酵液的喂饲试验，通过测定断奶幼仔的单窝存活率、整窝死亡率、免疫球蛋白数量、淋巴细胞阳性率、免疫器官指数等指标，以考察冬虫夏草菌丝体发酵液作为饲料添加剂对母兔产仔成活率以及对仔兔在断奶应激情况下免疫功能的影响，为家畜绿色饲料添加剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

冬虫夏草菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC50542。

基础日粮配方：玉米13%、麸皮20%、豆粕15%、苜蓿草粉8%、麦芽根5%、草粉35%、复合预混料4%。改良日粮配方：在基础日粮中添加2%冬虫夏草菌丝体发酵液。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose medium,PDA）：200 g土豆切成小块，加1 000 mL水于锅内，加热至沸腾，持续煮沸20～30 min，经纱布过滤至1 000 mL烧杯中，加葡萄糖20 g，补充水分到1 000 mL，分装于500 mL盐水瓶，300 mL/瓶，在121.3℃下灭菌30 min，冷却后备用。

PDA平板：在马铃薯葡萄糖液体培养基中加入20 g琼脂粉，同上灭菌后冷却至45℃左右，倒入无菌培养皿，得PDA平板。

1.3 冬虫夏草菌丝体发酵液制备

在无菌环境中，挑取冬虫夏草菌斜面菌苔接种于PDA平板，在20℃恒温培养箱中培养7 d后，挑取活化菌苔接种于PDA液体培养基，于20℃、150 r/min下振荡培养7 d，得冬虫夏草菌丝体发酵液，备用。

1.4 试验设计

獭兔喂饲试验在宁波绿兴农业科技有限公司进行。

1.4.1 孕期及哺乳期母兔喂饲试验

将80只体质量相近且刚配种的同期怀孕母兔随机分为2组，每组40只。对照组喂饲基础日粮，试验组喂饲改良日粮。试验从配种受孕开始至仔兔断奶结束。期间记录母兔产仔数、断乳仔兔存活率，测定哺乳期母兔免疫球蛋白含量。

1.4.2 断奶仔兔喂饲试验

从上述母兔喂饲的试验组所产仔兔中选取体质量相近的断奶仔兔10只，喂饲改良日粮（试验组Ⅰ）。从母兔喂饲试验的对照组所产仔兔中选取体质量相近的断奶仔兔20只，随机分为2组：一组喂饲基础日粮（对照组），另一组喂饲改良日粮（试验组Ⅱ）。饲养35 d后，测定供试仔兔的免疫器官指数和T淋巴细胞阳性率。

1.5 测定项目

1.5.1 存活率测定

记录供试母兔产仔数、断奶期仔兔存活数，计算断奶期仔兔单窝存活率和整窝死亡率。

1.5.2 免疫球蛋白的测定

在母兔喂饲试验中，随机取试验组和对照组哺乳期母兔各5只，禁食12 h，用采血器采血3 mL，保存于0℃下，备用。采用间接酶联免疫吸附法测定免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）的含量。

1.5.3 免疫器官指数测定

在仔兔喂饲试验中，随机取试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和对照组仔兔各3只，禁食12 h，用采血器采血3 mL，保存于0℃下，备用。仔兔采血后颈动脉放血致死，解剖，取蚓突、胸腺、脾、圆小囊4种免疫器官，剔去脂肪称量，计算免疫器官指数：

免疫器官指数=器官质量/mg÷活体质量/g。

1.5.4 T淋巴细胞阳性率

采用α-醋酸萘酯酶（α-acidalpha naphthyl aetate esterase,ANAE）法[5-7]测定仔兔喂饲试验中试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和对照组血样的T淋巴细胞阳性率，具体步骤如下：取血液推片，晾干，用福尔马林-丙酮缓冲液（pH=6.6）在4℃条件下固定1.5 min，流水冲洗3 min，再用蒸馏水冲洗，空气中干燥至少3 min；将血涂片浸入孵育液中，在37℃水浴箱内孵育3 h，自来水冲洗3 min，再用蒸馏水略洗；用1%甲基绿溶液染色15 min，自来水洗去多余染液，在空气中干燥。油镜检查200个淋巴细胞，胞质中出现红色反应产物者为ANAE阳性。

1.6 数据处理及分析

采用Excel 2010整理试验数据并作图；采用DPS 16.05软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 断奶仔兔成活状况比较

由表1可见：试验组和对照组各40只供试受孕母兔中分别有29只和24只产仔，平均单窝产仔数分别为4.7只与4.1只，经t检验表明，两者并无明显差异（P=0.22）；而试验组的断奶仔兔单窝成活率显著高于对照组28个百分点（P=0.02）。表2显示，断奶仔兔整窝成活率或部分成活率在试验组与对照组间均无显著差异（P=0.34或0.29），而试验组断奶仔兔的整窝死亡比率低于对照组33.5个百分点（P=0.02）。上述结果表明，母兔孕期与哺乳期喂饲添加冬虫夏草菌丝体发酵液的改良日粮可明显提高断奶期仔兔的单窝成活率，显著降低整窝死亡率。

2.2 哺乳期母兔免疫球蛋白含量比较

哺乳期母兔的IgA与IgG含量如表3所示。其中试验组的IgA含量显著高于对照组（P＜0.01），而IgG含量在两组间未见显著差异（P＞0.05）。

表1 不同处理单窝产仔数及断奶仔兔成活率比较Table 1 Comparison of cub numbers and survival rate of weaning rabbits per mother rabbit between treatments

表2 不同处理断奶仔兔整窝成活状况比较Table 2 Comparison of weaning rabbit survival conditions of whole nest between treatments

表3 不同处理哺乳期母兔免疫球蛋白含量比较Table 3 Comparison of immune globulin content of mother rabbits in lactation between treatments

相同小写字母表示在P＜0.05水平差异无统计学意义；不同大写字母表示在P＜0.01水平差异有高度统计学意义。

The same lowercase letter indicates no significant difference at the 0.05 probability level;different uppercase letters indicate highly significant difference at the 0.01 probability level.

2.3 断奶仔兔T淋巴细胞阳性率比较

仔兔喂饲试验中各组T淋巴细胞阳性率如图1所示。试验组Ⅰ和Ⅱ的T淋巴细胞阳性率均显著高于对照组（P＜0.01），而试验组Ⅰ显著高于试验组Ⅱ。

2.4 断奶仔兔免疫器官指数比较

由表4可知：试验组Ⅰ和Ⅱ的蚓突指数显著高于对照组（P＜0.01），而试验组Ⅰ与Ⅱ之间未见显著差异；从数据上看，除胸腺指数外，试验组Ⅰ和Ⅱ各项器官指数均高于对照组，但差异未达显著水平（P＞0.05）。

图1 仔兔喂饲试验中不同处理的T淋巴细胞阳性率比较Fig.1 Comparison of positive T lymphocyte rate of young rabbits in different treatments

3 讨论

从初生到断奶阶段的小兔称为仔兔，从断奶至75日龄的小兔称为幼兔。这2个阶段的兔因其生命力和消化机能较弱，抗病力差，容易发生消化系统疾病，如果饲养不善，则死亡率较高，有的高达60%～70%[8]。喂饲添加冬虫夏草菌丝体发酵液的改良日粮后，怀孕母体产仔数有所提高，仔兔的存活率显著高于对照组，这在一定程度上反映了仔兔抗病能力的增强。其可能原因是冬虫夏草菌丝体含有虫草素等增强免疫以及抗病能力的有效成分，其机制有待进一步研究。

表4 冬虫夏草对仔兔免疫器官指数的影响Table 4 Effects of Cordyceps sinensis on the immune organ index of young rabbits

脾、胸腺、蚓突、圆小囊是兔的重要免疫器官。一般认为，免疫器官质量增加是免疫增强的表现[9-10]。本研究发现，在仔兔日粮中添加冬虫夏草菌丝体发酵液可以显著提高仔兔蚓突指数，并且喂饲改良日粮的仔兔器官发育更快更大，说明冬虫夏草菌丝体可以促进仔兔免疫器官综合发育，促进机体免疫机能成熟，这也许是该添加剂提高仔兔免疫能力的途径之一。

本文采用α-醋酸萘酯酶（ANAE）反应试验测定了T淋巴细胞中的酯酶，结果表明，试验组显著高于对照组。而ANAE阳性淋巴细胞率反映了成熟T淋巴细胞的含量，代表了机体细胞免疫水平。说明冬虫夏草的有效成分可能通过促进T淋巴细胞的成熟来提高免疫水平，其机制尚不明确。

免疫球蛋白是动物受到抗原刺激后，体内产生的一类能与抗原特异性相互作用的球蛋白。IgG和IgA是仔兔体内2种重要的免疫球蛋白。其中：IgG是生物体液内主要的免疫球蛋白，是机体抗感染免疫的主力抗体[11-12]；IgA在血清中的含量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白总量的10%～20%，在抵抗病原入侵方面极其重要[13]。本研究中，在怀孕母兔的日粮中添加冬虫夏草菌丝体发酵液能显著提高IgA的含量，这也可能是该添加剂通过增强体液免疫功能来提高怀孕母兔的免疫水平。

综上所述，对孕期及哺乳期母兔喂饲添加冬虫夏草菌丝体发酵液的改良日粮，有利于降低仔兔死亡率、提高母兔IgA含量，对断乳幼兔喂饲改良日粮有利于提高免疫器官质量和T淋巴细胞阳性率。由此可见，冬虫夏草菌丝体发酵液作为饲料添加剂是一种很好的免疫增强剂，能在一定程度上促进仔兔的免疫器官发育，提高仔兔免疫水平。而且冬虫夏草菌丝体发酵液纯天然，无耐药性、无毒副作用，是一款绿色、环保、无害、高效的免疫增强剂，在一定程度上可以减少抗生素的滥用，对我国实施健康绿色生态养殖具有积极的意义。

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