响应面法优化超声波微波协同提取树莓多酚工艺研究

（河南科技学院新科学院，河南新乡453003）

河南省是树莓（Raspberry）的天然有机场，非常适合树莓的生长，目前在河南延津建有千亩树莓基地，是中原地区特色农产品[1]。树莓是膳食多酚的丰富来源，研究表明日常食用树莓可以改善血脂异常，抗菌消炎，减少人体和动物慢性疾病的氧化应激反应[2-6]。树莓多酚中的花青素在浓度为50 μg/mL能够抑制脂质氧化，抑制率超过50%，在浓度为100 μg/mL时对环氧化酶的抑制率为27.5%～33.1%[7]，树莓花青素还具有抑制细胞毒素形成和体外抗氧化能力，抑制动脉硬化，抑制癌细胞增殖的能力等功能[8]。Tulio等[9]的研究证明树莓多酚具有较强的抗菌消炎能力，并对抗癌活性进行了验证。通过成熟树莓多酚和其中各单体酚抗氧化能力测定发现，鞣花酸在树莓多酚的抗氧化能力中占主要地位，对DPPH·和·OH都有较好的清除作用，清除率分别达到57.82%和74.8%[10-11]。另有学者研究证明树莓多酚中的鞣花酸通过抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡途径治疗人体宫颈癌，并取得了显著的疗效[12-13]。

在提取多酚的工艺过程中，超声波辅助提取、微波辅助提取已经有了广泛的应用[14-18]，这两种方法比直接溶剂萃取的效率有了很大的提升，但是这两种方法提取温度高、提取时间长会导致多酚在提取过程中发生降解。而超声波-微波协同提取新技术合理利用超声波的空化效应和微波高能释放的热效应，集超声波微波两者优势于一体，克服了单独使用超声波或微波提取的缺陷，解决了在低温常压环境下，对植物中活性成分的快速、高效提取，且大大降低了目标成分被破坏的风险[19-22]，目前超声波微波协同提取法在树莓多酚提取方面的研究较少。为了最大化的提取树莓多酚，在超声波微波协同提取时要考虑提取时间，提取温度，乙醇体积分数，超声波微波功率等单因素对试验结果的影响，并进行条件优化，一般来说，优化提取工艺可以通过验证或者统计学的方法，相比较来说，统计学方法可以减少试验次数并验证各因素间交互作用，响应面法就是一种具有代表性的统计学方法，已经被广泛在农业和工程方向用于改进、提高和优化工艺[23]，但是在超声波微波协同提取树莓多酚方面还没有应用。

本研究以树莓为原料，利用超声波微波协同技术提取树莓多酚，采用响应面法优化树莓多酚的提取工艺，提高树莓多酚的提取率，为红树莓多酚的进一步研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

树莓：2017年5年采于河南延津树莓基地，成熟期采摘，采摘后立即储存在液氮中，后在-80℃冰箱中速冻，冷冻干燥称粉末，置于-20℃冰箱中保存，使用前解冻。

没食子酸：Sigma公司；福林酚试剂：北京索莱宝公司；抗坏血酸、柠檬酸、乙醇：国药集团化学试剂有限公司，试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

CW-2000型超声波-微波协同萃取仪：上海新拓分析仪器科技有限公司；UV7500型紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；KQ-100E型超声波清洗器：上海精密仪器有限公司；DHG-9620A型恒温干燥箱：上海和呈仪器制造有限公司；SW22型恒温水浴锅：德国JULABO公司；JA2003型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 多酚标准曲线的建立

采用优化的福林酚法测定树莓多酚含量，以没食子酸为标品，分别配成不同浓度加入福林酚试剂，避光条件下，室温反应2 h，在765 nm条件下测定吸光值，以吸光度值为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标建立标准曲线。建立的标准曲线回归方程为：y=0.231 1x+0.003 2，R2=0.998 3，y 为 OD765，x 为没食子酸质量浓度。树莓多酚提取液稀释至合适浓度，加入福林酚试剂反应，通过标准曲线得出多酚含量。

1.3.2 树莓多酚提取工艺

在250 mL锥形瓶中加入一定体积分数的乙醇100 mL、5 g树莓冻干粉和1%的抗坏血酸搅拌均匀，置于超声波微波协同萃取仪中，在一定功率、温度和时间条件下萃取，然后将萃取液进行抽滤弃去滤渣，上清液旋转蒸发浓缩至10 mL，通过标准曲线计算出多酚含量。总酚含量单位用mg等量没食子酸/g干重表示。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 提取时间对树莓多酚含量的影响

称取5份5g树莓冻干粉，在乙醇体积分数为60%，提取温度为30℃，超声波微波功率300 W条件下，分别提取 10、15、20、25、30min，考察不同提取时间对树莓多酚含量的影响。

1.3.3.2 提取温度对树莓多酚含量的影响

称取5份5g树莓冻干粉，在乙醇体积分数为60%，提取时间为20 min，超声波微波功率300 W条件下，分别改变提取温度 20、25、30、35、40 ℃，考察不同提取温度对树莓多酚含量的影响。

1.3.3.3 乙醇体积分数对树莓多酚含量的影响

称取5份5 g树莓冻干粉，在提取时间为20 min，提取温度为30℃，超声波微波功率300 W条件下，分别添加体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，考察不同体积分数乙醇对树莓多酚含量的影响。

1.3.3.4 超声波微波功率对树莓多酚含量的影响

称取5份5g树莓冻干粉，在乙醇体积分数为60%，提取温度为30℃，提取时间为20 min，分别设定超声波微波功率 200、250、300、350、400 W，考察不同超声波微波功率对树莓多酚含量的影响。

1.3.4 响应面设计

选取提取时间、提取温度、乙醇体积、超声波微波功率4个单因素进行试验，在此基础上选择提取时间、提取温度和乙醇体积3个对树莓多酚含量影响显著的因素，采用Design-Expert8.0建立三因素三水平的Box-Behnken模型，试验设计因素编码水平如表1所示。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 数据分析

每组试验测定3次，试验结果采用平均值±标准差表示，用Design-Expert8.0进行响应面设计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 微波超声波协同提取树莓多酚单因素试验

2.1.1 提取时间对树莓多酚含量的影响

提取时间对树莓多酚含量的影响结果如图1所示。

图1 提取时间对树莓多酚含量的影响Fig.1 Effect of extraction time on raspberry polyphenols

当提取时间在10 min～20 min时，树莓多酚的含量随着提取时间的延长而提高，当提取时间超过20 min，树莓多酚的含量有所下降，这是因为随着时间的延长，提取出的树莓多酚部分氧化降低了提取液中树莓多酚的含量。在提取时间20 min时多酚含量达到最大值75.87 mg/g，因此选择提取时间为20 min。

2.1.2 提取温度对树莓多酚含量的影响

提取温度对树莓多酚含量的影响结果如图2所示。

当提取温度在20℃～30℃时，树莓多酚的含量随着提取温度的升高而提高，当提取温度超过30℃，树莓多酚的含量呈现下降趋势，这是因为随着温度的升高，树莓多酚部分氧化降低了提取液中树莓多酚的含量。在提取温度30℃时多酚含量达到最大值75.04 mg/g，因此选择提取温度为30℃。

图2 提取温度对树莓多酚含量的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on raspberry polyphenols

2.1.3 乙醇体积对树莓多酚含量的影响

乙醇体积对树莓多酚含量的影响结果如图3所示。

图3 乙醇体积分数对树莓多酚含量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on raspberry polyphenols

当乙醇体积低于60%时，树莓多酚的含量随着乙醇体积的增加而提高，当乙醇体积超过60%，树莓多酚的含量呈下降趋势，这是因为在乙醇体积分数较低时，乙醇可以破坏细胞壁进入细胞内部将酚类物质溶出，当乙醇体积分数较高时，乙醇引起蛋白质变性在细胞壁形成致密结构阻碍酚类物质的溶出。在乙醇体积60%时多酚含量达到75.32 mg/g，选择乙醇体积为60%。

2.1.4 超声波微波功率对树莓多酚含量的影响

超声波微波功率对树莓多酚含量的影响结果如图4所示。

图4 超声波微波功率对树莓多酚含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic microwave power on raspberry polyphenols

树莓多酚的含量随着超声波微波功率的提高而缓慢提高，但是经过方差分析发现不同超声波微波功率条件下的多酚含量没有显著性差异（p＜0.05）。考虑到经济成本选择超声波微波功率为300 W，此因素不作为响应面试验的因素。

2.2 模型和方差分析

根据单因素试验设计了因素水平表（表1）进行响应面试验，将每组试验结果填入表2，用Design-experts软件进行方差分析（表3）。

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface experiment results

表3 模型方差分析表Table 3 ANOVA of model

通过二次多项回归分析得到如下回归方程：

其中Y是响应值（树莓多酚含量），A、B、C分别代表单因素提取时间，提取温度和乙醇体积3个自变量。

由方差分析表可知模型的F=14.84，p=0.000 9＜0.01，说明总模型极显著，失拟项F=2.23，p=0.227 3＞0.05，说明失拟项相对于纯误差来说是不显著的，而模型决定系数R2=0.950 2表明该模型拟合程度良好，综合以上结果表明这个模型方程适合任意变量组合下的多酚预测。提取时间一次项和二次项、提取温度二次项极显著，提取温度和乙醇体积分数交互项、乙醇体积分数二次项显著。根据各因素F值可知各因素对树莓多酚提取影响力的关系为提取时间＞乙醇体积分数＞提取温度。

2.3 响应面分析

图5 提取时间和提取温度对树莓总多酚影响的响应面图Fig.5 Effect of extraction time and temperature on total polyphenols from raspberry

响应面试验的自变量交互作用通过三维图和等高线图来表示（如图5～图7），等高线呈椭圆状越明显说明交互作用越显著，对树莓多酚含量的影响越显著，由等高线图可以看出任意两因素交互作用的显著程度，提取温度和乙醇体积分数的交互作用显著。通过软件Design-Expert优化出的工艺条件是：提取时间21.85 min，提取温度30.07℃，乙醇体积分数57.78%，树莓多酚的含量预测值为76.77 mg/g。

图6 提取时间和乙醇体积分数对树莓总多酚影响的响应面图Fig.6 Effects of extraction time and ethanol volume on total polyphenols from raspberry

2.4 验证试验

由于工艺参数有小数出现，在实际操作中无法控制，所以将优化的工艺条件再次优化，提取时间22 min，提取温度30℃，乙醇体积分数60%，在此工艺条件下重复提取树莓多酚5次，获得的树莓多酚含量（76.85±0.084）mg/g与预测值非常接近，两者没有显著性差异（p＜0.05），进一步验证了优化的工艺条件的稳定性。

3 结论

通过单因素试验和响应面试验，优化出超声波微波协同提取树莓多酚的工艺条件为：提取时间22 min，提取温度30℃，乙醇体积分数60%，在此工艺条件下树莓多酚含量为（76.85±0.084）mg/g，三因素对响应值的主次顺序为：提取时间＞乙醇体积分数＞提取温度，其中提取时间对树莓多酚含量影响极为显著。本研究建立的提取工艺提高了树莓多酚的提取效果，试验在较低温度下进行减少了树莓多酚氧化，极大程度保留树莓多酚的活性，是一种可广泛应用的树莓多酚的提取方法，可为树莓多酚的工业化生产提供研究基础。