TGF-β1对AngⅡ作用后的心肌细胞表面积和心钠素合成影响

聂明，金培印

心肌缺血、高血压等心血管系统疾病的发生与心肌肥厚有关，是心脏受到多种刺激以后产生的一种代偿性的反应，是猝死、心力衰竭等发生的危险因素，肾素-血管紧张素系统是心室肥厚发生的重要原因，而血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统中重要的促心肌细胞肥大因子[1,2]。转化生长因子β1（TGF-β1）具有广泛的生物学作用，其是生长因子超家族中的一员，在胚胎发育、免疫反应、肿瘤发生等过程中具有重要作用[3,4]。近年来的研究显示，TGF-β1参与心力衰竭发生，在心力衰竭大鼠模型中表达升高，并且可以调控细胞的生长、凋亡等过程，在心肌纤维化和细胞外基质的异常增多等过程中发挥关键作用[5,6]。本实验拟通过体外分离培养乳鼠心肌细胞，探讨TGF-β1在AngⅡ诱导的心肌肥大中的作用，并对其作用机制进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象和分组出生72 h的SD乳鼠由华中科技大学同济医学院动物实验室提供；参照文献[7]，取出生72 h的SD乳鼠，用乙醚麻醉以后，取出心脏，用眼科剪把心肌组织剪碎（＜1 mm3），添加5倍体积的消化酶（0.125%胰蛋白酶+0.04%的EDTA），混合后，在提前预热的37℃的水浴中消化5 min。静置3 min，把上清吸除。在沉淀中加入5倍体积的0.1%的Ⅰ型胶原酶，继续在37 ℃的水浴中消化5 min。吸取上清，加入到15%胎牛血清的DMEM中，重复用Ⅰ型胶原酶消化直至组织消化完全。将消化后的所有上清以1200 g离心10 min，在细胞沉淀中加入PBS洗涤2次。用15%胎牛血清的DMEM悬浮细胞，按照约106个细胞/ml种植到细胞瓶中，贴壁差1 h分离心肌细胞。心肌细胞经α-actin免疫组化测定分离的心肌细胞纯度超过95%。原代的心肌细胞分为5组，分别为：对照组、AngⅡ组、实验1组、实验2组、实验3组。AngⅡ组、实验1组、实验2组、实验3组在实验0 h时在细胞培养液中添加0.1 μmol/L的AngⅡ；实验1组、实验2组、实验3组在实验0 h时同时在细胞培养液中添加20、30、40 μmol/L的TGF-β1抑制剂SB431542；对照组为常规条件下培养的原代心肌细胞。

1.2 主要试剂TGF-β1抑制剂SB431542购自美国Selleck；胰蛋白酶、AngⅡ、Ⅰ型胶原酶购自美国Sigma；一氧化氮（NO）含量测定试剂盒购自上海翊圣生物；TRIZOL裂解试剂购自上海碧云天；TGF-β1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物为上海生工合成；B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）一抗、smad2一抗购自美国PL Laboratories；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒购自北京博凌科为；心钠素含量测定试剂盒购自北方免疫试剂研究所；辣根过氧化物标记的二抗购自北京百奥莱博。

1.3 AngⅡ作用后的心肌细胞中TGF-β1 mRNA表达测定取心肌细胞，按照对照组和AngⅡ组方法分别处理48后，用TRIZOL提取各组心肌细胞中的RNA，测定RNA的A260/A280的比值处于1.8～2.0之间。逆转录合成cDNA后进行RT-PCR。TGF-β1上游引物（5，-3’）CTGGCGATACCTCAGCAAC，下游引物（5，-3’）TAAGGCGAAAGCCCTCAAT。G A P D H上游引物（5，-3’）CCTGCACCACCAACTGCTTAG，下游引物（5，-3，）CAGYCTTCTGGGTGGCAGTGA。2-△△Ct法以GAPDH为内参分析TGF-β1水平。

1.4 AngⅡ作用后的心肌细胞中TGF-β1蛋白表达测定取心肌细胞，按照对照组和AngⅡ组方法分别处理48 h后，收集各组细胞，按照1000 g离心10 min，加入PBS洗涤2次，每次洗完以后1000 g离心10 min。再加入细胞裂解液，把细胞放在冰上孵育15 min。低温4 ℃离心5 min，转速为12 000 g，收集上清保存在-20 ℃冰箱中。待测蛋白样品用BCA法定量，用Loading buffer煮沸变性以后，每个泳道内添加50 μg的样品，100 V电泳至溴酚蓝距离底部2 cm处停止电泳。转膜：电压为90 V，电转时间为90 min。封闭：在室温，用5%脱脂奶粉封闭1 h。把TGF-β1一抗按照1:600稀释，将膜放在稀释后的一抗中，在4 ℃过夜。把二抗按照1:3000稀释以后，把膜放在稀释后的二抗中，在室温孵育60 min。显色，光密度扫描仪对蛋白进行定量，GAPDH为内参。

1.5 细胞表面积检测对照组、AngⅡ组、实验1组、实验2组、实验3组细胞分别培养48 h以后，随机选取5个视野，每个视野选取10个细胞，用SimplePCI软件检测细胞的表面积，取均值。

1.6 心钠素合成检测用免疫放射法测定心肌细胞中心钠素的表达。对照组、AngⅡ组、实验1组、实验2组、实验3组细胞分别培养48 h以后，收集培养液上清，与4 ℃预冷的7.5%的EDTA二钠、抑肽酶混合后，在-20 ℃保存。按照心钠素含量测定试剂检测样品中的心钠素的含量。

1.7 心肌细胞蛋白含量检测对照组、AngⅡ组、实验1组、实验2组、实验3组细胞分别培养48 h以后，消化细胞，对细胞进行计数，提取细胞蛋白，用蛋白含量测定试剂盒测定蛋白含量，计算每个细胞中蛋白含量。

1.8 NO含量测定对照组、AngⅡ组、实验1组、实验2组、实验3组细胞分别培养48 h以后，收集培养液上清，以硝酸还原法测定样品中的NO含量，步骤参照试剂盒说明书。

1.9 Western blot测定Bcl-2、smad2蛋白水平对照组、AngⅡ组、实验1组、实验2组、实验3组细胞分别培养48 h以后，按照上述材料与方法5中Western blot法测定各组心肌细胞中Bcl-2、smad2蛋白水平。

1.10 统计学分析实验重复3次，取均值。所有实验数据用SPSS 21.0统计分析，计量资料用平均数±标准差（±s）表示，两组数据用独立样本t检验，多组差异之间的比较用单因素方差，组间比较用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AngⅡ作用后的心肌细胞中TGF-β1的表达

从图1和表1可以看出，心肌细胞经过AngⅡ处理后细胞中的TGF-β1 mRNA和蛋白水平均明显升高，说明AngⅡ诱导心肌细胞中TGF-β1的转录和表达。

图1 Western blot测定AngⅡ作用后的心肌细胞中TGF-β1蛋白水平（TGF-β1：转化生长因子β1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶）

2.2 TGF-β1抑制后对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的影响从表2可以看出，AngⅡ作用后的心肌细胞表面积明显增加，并且心肌细胞合成的心钠素水平也明显升高，心肌细胞蛋白含量也明显升高，而心肌细胞合成的NO含量下降。用不同浓度的TGF-β1抑制剂作用后的心肌细胞表面积有所降低，细胞合成的心钠素减少，心肌细胞蛋白含量也下降，心肌细胞合成的NO水平升高。AngⅡ诱导心肌细胞肥大，减少NO合成，而TGF-β1抑制剂可以呈浓度依赖的拮抗AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，促进NO合成。

表1 AngⅡ作用后的心肌细胞中TGF-β1蛋白水平（±s）

表1 AngⅡ作用后的心肌细胞中TGF-β1蛋白水平（±s）

注：AngⅡ：血管紧张素Ⅱ；与对照组相比，aP＜0.05；TGF-β1：转化生长因子β1

组别 TGF-β1蛋白水平 TGF-β1 mRNA对照组 0.26±0.03 1.00 AngⅡ组 1.03±0.09a 3.87±0.36a t值 14.058 13.808 P值 0.000 0.000

2.3 TGF-β1抑制后对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡影响从图2和表3可以看出，AngⅡ作用后的心肌细胞凋亡率升高，而用不同浓度的TGF-β1抑制剂作用后的心肌细胞凋亡率下降。AngⅡ诱导心肌细胞凋亡，而TGF-β1抑制剂可以呈浓度依赖的减弱AngⅡ诱导心肌细胞凋亡作用。

2.4 TGF-β1抑制后对AngⅡ作用后的心肌细胞中Bcl-2、smad2蛋白表达影响从图3和表4可以看出，AngⅡ作用后的心肌细胞中Bcl-2蛋白水平下降，smad2表达增多，而用不同浓度的TGF-β1抑制剂作用后的心肌细胞中Bcl-2蛋白表达增多，smad2表达减少。TGF-β1抑制剂可以呈浓度依赖的拮抗AngⅡ对心肌细胞中Bcl-2、smad2表达影响。

表2 各组细胞表面积、蛋白含量及合成心钠素、NO水平比较（±s）

表2 各组细胞表面积、蛋白含量及合成心钠素、NO水平比较（±s）

注：AngⅡ：血管紧张素Ⅱ；NO：一氧化氮；与对照组相比，aP＜0.05；与AngⅡ组相比，bP＜0.05；与实验1组相比，cP＜0.05；与实验2组相比，dP＜0.05

组别 细胞表面积（μm2） 心钠素（ng/ml） 心肌细胞蛋白含量（pg） NO（μmol/L）对照组 1554.32±116.25 398.24±33.26 413.25±25.18 14.36±1.20 AngⅡ组 3351.26±235.68a 816.36±55.91a 984.61±65.87a 7.61±0.74a实验1组 2863.15±121.57b 632.17±28.65b 846.28±88.36b 12.31±1.24b实验2组 2361.87±237.29bc 538.64±33.28bc 746.32±69.97bc 14.59±1.47bc实验3组 1964.23±134.68bcd 461.97±27.86bcd 589.27±63.89bcd 18.72±1.83bcd F值 47.955 57.689 34.084 27.096 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

近年来，随着对心肌肥厚的不断研究，人们逐渐发现心肌重塑是心力衰竭发生的重要原因，在心肌重塑过程中常常伴随着心肌细胞过度凋亡、心肌细胞肥大等病理学变化，这些病理变化可以引发心室容量异常增加、心室形状异常等现象，造成心肌损伤[8]。TGF-β1是一种在血小板中发现的效应因子，是TGF-β异构体中的一种，在人体内广泛表达，其具有诱导细胞外基质的形成、降低免疫反应等作用[9]。TGF-β1参与人体的多种慢性纤维性疾病的发生，如肾小球肾炎、肺纤维化、类风湿性关节炎、心肌纤维化等，TGF-β1过度表达是多种慢性纤维性疾病发生的重要原因[10,11]。最近的研究表明，TGF-β1在心力衰竭中高表达，且与心肌肥厚有关[12,13]。本实验结果表明，AngⅡ处理后的心肌细胞中的TGF-β1 mRNA和蛋白水平均升高，这与上述实验报道相一致，都说明TGF-β1与心肌肥厚有关。

心肌肥厚与心肌细胞肥大有关，而心肌细胞肥大主要表现为心肌细胞表面积增大和心钠素合成增多，心钠素是心肌细胞的胚胎基因，在心肌肥厚组织中表达增多[14]。NO具有调控心室重构的作用，能够传导细胞信号和调控血管舒张，具有保护心肌组织的功能，其在心力衰竭心肌组织中水平下调[15]。很多研究报道表明，AngⅡ能够诱导心肌细胞表面积增加，心钠素合成增加，促进心肌细胞肥大的发生[16]。本实验结果表明，AngⅡ处理后的心肌细胞合成的NO水平降低，心钠素合成增加，细胞表面积增加，细胞中的蛋白含量增加，而TGF-β1抑制剂可以逆转AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，促进细胞合成NO，抑制TGF-β1具有保护心肌组织的作用。

图2 TGF-β1抑制剂对AngⅡ作用后的心肌细胞凋亡影响

表3 各组细胞凋亡率比较（±s）

表3 各组细胞凋亡率比较（±s）

注：AngⅡ：血管紧张素Ⅱ；与对照组相比，aP＜0.05；与AngⅡ组相比，bP＜0.05;与实验1组相比，cP＜0.05；与实验2组相比，dP＜0.05

组别 细胞凋亡率（%）对照组 6.87±0.67 AngⅡ组 31.68±3.61a实验1组 25.61±2.38b实验2组 20.36±2.15bc实验3组 14.28±1.28bcd F值 55.033 P值 0.000

图3 Western blot测定细胞中Bcl-2、smad2蛋白水平

表4 各组细胞中Bcl-2、smad2蛋白水平比较（±s）

表4 各组细胞中Bcl-2、smad2蛋白水平比较（±s）

注：AngⅡ：血管紧张素Ⅱ；与对照组相比，aP＜0.05；与AngⅡ组相比，bP＜0.05；与实验1组相比，cP＜0.05；与实验2组相比，dP＜0.05

组别 Bcl-2蛋白 smad2蛋白对照组 1.18±0.21 0.36±0.05 AngⅡ组 0.20±0.01a 1.42±0.18a实验1组 0.39±0.02b 0.95±0.07b实验2组 0.57±0.05bc 0.66±0.05bc实验3组 0.91±0.07bcd 0.45±0.07bcd F值 45.072 58.592 P值 0.000 0.000

心肌肥厚发生以后，心肌细胞在高负荷的刺激下体积不断增加，心脏为了维持心肌组织的正常功能而启动凋亡程序，诱导细胞凋亡发生，这样就使得心肌肥厚由原来的代偿期逐渐转化为失代偿期，造成心肌数目异常减少，导致心功能受损，进一步促进心肌肥厚发展为心力衰竭[17]。AngⅡ不仅能够诱导心肌细胞肥大，而且还能够促进心肌细胞凋亡[18]。Bcl-2是与心肌细胞凋亡有关的一种抗凋亡蛋白，其表达水平升高后可抑制细胞凋亡的发生[19]。在本实验中发现，TGF-β1被抑制后可减少AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡，促进心肌细胞中Bcl-2的表达，说明TGF-β1对心肌细胞肥大的作用机制可能与减少心肌细胞凋亡有关。

TGF-β1在细胞膜上与其受体特异性结合以后，可以促进其下游的受体激活，而smad2是这一过程中的调节型受体，TGF-β1与smad2结合形成异聚体以后可以转移至细胞核内，从而调控相关转录因子的表达[20,21]。smad2已经被证实参与心肌肥厚的发生，在心肌肥厚组织中表达上调[22]。本实验显示，AngⅡ促进心肌细胞中smad2的表达，而TGF-β1被抑制以后可以降低细胞中smad2蛋白水平，这提示TGF-β1可能通过作用于smad2影响AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，而对于其具体的作用机制仍需日后进行探讨和验证。

AngⅡ诱导心肌细胞中TGF-β1高表达，下调TGF-β1可以减弱AngⅡ对心肌细胞肥大的诱导作用，这可能与减少心肌细胞凋亡、促进NO合成和减少smad2蛋白表达有关，本研究在原代心肌细胞中进行了探讨，以后会在多株心肌细胞及体内进行验证，以期为明确TGF-β1在心肌肥厚中的作用奠定基础。