Corin基因通过NF-κB信号通路对心肌细胞增殖凋亡的机制研究

李岩松，姜衡，费民忠，夏静雯，魏永

氧化应激是机体产生的氧化与抗氧化不平衡状态，大量氧自由的产生可造成组织炎症反应和氧化应激损伤，是一个引起心血管疾病功能异常、心肌细胞凋亡或损伤的重要因素，与心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病存在密切联系[1-3]。在心血管疾病发生发展中心肌细胞凋亡贯穿整个过程，因此寻找降低心肌细胞凋亡的途径及研究其机制尤为重要。目前已发现多个降低心肌细胞凋亡的分子靶点，如miR-24、miR-221等[4,5]，但仍需发现更多的分子靶点。心房利钠肽（ANP）属于利钠肽家族，由心房的心肌细胞产生、储存和分泌，参与心血管系统的生理及病理过程，可保护心血管系统[6,7]。Corin是一种新发现的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，主要表达在心脏，可将利钠肽（NP）前体转化为有生物学活性的NP，从而发挥改善心功能作用[8]。近几年研究发现Corin基因活性降低可能与高血压、心脏病、心力衰竭等心血管疾病发生有关[9,10]。本研究中我们主要研究Corin对过氧化氢（H2O2）诱导的心肌细胞生物特性及调控机制。

1 资料与方法

1.1 细胞分组及处理H9c2细胞购自美国ATCC。H9c2细胞在DMEM培养基（含有10%小牛血清、青霉素和链霉素各100 U/ml）中，于5%体积分数CO2及95%饱和湿度的恒温培养箱中37℃培养，细胞达80%以上生长密度时，胰蛋白消化后传代。将H9c2细胞分为空白对照组（Control组）、pcDNA3.1组、过氧化氢（H2O2）组、pcDNA3.1-C o r i n组。空白对照组细胞无特殊处理，pcDNA3.1组加入pcDNA3.1载体，H2O2组使用150 μmol/L的H2O2处理空白细胞6 h，pcDNA3.1-Corin组参照脂质体LipofectamineTM2000转染pcDNA3.1-Corin后再用150 μmol/L的H2O2处理细胞6 h。6 h后换为含有血清的培养基继续培养，用于实验研究。

1.2 主要试剂和仪器DMEM培养基及青链霉素均购自美国Gibco；胎牛血清、LipofectamineTM2000均购自美国Invitorgen公司；CCK8试剂、BAY 11-7082均购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD公司；ki67、p53、NF-κB IκBα抗体均购自美国SantaCrus公司；酶标仪购自美国Biotek公司。

1.3 蛋白质印迹加入适量的蛋白质裂解液于转染24 h的各组细胞中，细胞置于冰上充分裂解反应30 min收集蛋白，BCA测定总蛋白浓度，每泳道中加入100 ℃变性蛋白50 μg进行电泳分离，电泳后通过电转移至PVDF膜，转好的PVDF膜置于50 g/L的脱脂奶粉封闭液中封闭2 h，洗膜，4℃孵育适当稀释比例的ki67、p53、NF-κB IκBα和内参GAPDH抗体过夜，洗膜后加入稀释好的HRP标记的羊抗兔抗体，孵育2 h，洗膜后ECL试剂显色，置于暗室中显影定影。

1.4 细胞活力检测细胞活力检测通过细胞计数试剂盒（CCK8）法。每孔5000个细胞将H9c2细胞接种于96孔板，置于培养箱中培养12 h以上，观察细胞是否贴壁，在贴壁均匀的96孔板中，参照1.3分组用pcDNA3.1组、H2O2组、pcDNA3.1-Corin处理细胞，每组设置5个复孔，24 h后加入CCK8试剂10 μl在每个细胞孔中，酶标仪测定各组各个孔的吸光度值（OD值）（波长为490 nm）。以OD值反映细胞活力，可间接反映出细胞的增殖能力，实验重复3次。

1.5 细胞凋亡检测细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒。处理后的细胞使用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次，binding buffer重悬细胞，洗涤细胞后加入胰蛋白酶消化细胞，离心后收集1～5×105个细胞，细胞中分别加入AnnexinV-FITC（250 μg/ml）和PI（250 μg/ml）5 μl，避光条件室温反应5～15 min，1 h内上机，流式细胞仪检测凋亡率。实验重复3次。

1.6 抑制NF-κB信号通路对心肌细胞增殖凋亡的影响BAY 11-7082作为NF-κB信号通路抑制剂，细胞通过pcDNA3.1-Corin和pcDNA3.1-Corin+BAY 11-7082（10 μmol/L） 处理（pcDNA3.1-Corin+BAY 11-7082组）。参照上述方法检测各组细胞活力和凋亡情况。

1.8 统计学方法所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料用平均数±标准差（±s）表示，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-Corin转染H9c2细胞的效果Western blotting检测的pcDNA3.1-Corin转染H9c2细胞的效果如图1和表1所示，pcDNA3.1组Corin的表达与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），H2O2组Corin的表达显著低于对照组（P＜0.05），低于pcDNA3.1-Corin组（P＜0.05）。

图1 pcDNA3.1-Corin转染H9c2细胞的效果（Control：对照组；pcDNA3.1：pcDNA3.1载体；H2O2：过氧化氢；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶）

2.2 过表达Corin对H2O2诱导的H9c2细胞活力及凋亡的影响通过脂质体LipofectamineTM2000转染pcDNA3.1-Corin后再用H2O2处理H9c2细胞，检测的细胞活力及凋亡结果如图2和表2所示，与pcDNA3.1组比较，H2O2组细胞活力显著降低（P＜0.05），凋亡率显著升高（P＜0.05）；与H2O2组比较，pcDNA3.1-Corin组细胞活力显著升高（P＜0.05），凋亡率显著降低（P＜0.05）。

2.3 过表达Corin对H2O2诱导的H9c2细胞增殖凋亡蛋白及NF-κB信号通路的影响各组细胞中增殖凋亡相关蛋白ki67、p53及细胞核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路NF-κB 和IκBα的蛋白表达结果如图3和表3所示，与pcDNA3.1组比较，H2O2组ki67和IκBα的表达均显著降低（P＜0.05），p53和NF-κB的表达均显著升高（P＜0.05）；与H2O2组比较，pcDNA3.1-Corin组ki67和IκBα的表达均显著升高（P＜0.05），p53和NF-κB的表达均显著降低（P＜0.05）。

表1 pcDNA3.1-Corin转染H9c2细胞后各组细胞中Corin的蛋白相对表达量

图2 过表达Corin对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡的影响（pcDNA3.1：pcDNA3.1载体；H2O2：过氧化氢；PI：碘化丙啶；Annexin V-FITC：膜联蛋白 V-FITC）

表2 过表达Corin对H2O2诱导的H9c2细胞活力及凋亡的影响

2.4 过表达Corin通过NF-κB信号通路对H2O2诱导的H9c2细胞活力及凋亡的影响BAY 11-7082作为NF-κB信号通路抑制剂，通过过表达Corin及BAY 11-7082共同处理H9c2细胞，细胞活力及凋亡检测结果如图4和表4所示，与pcDNA3.1-Corin组比较，pcDNA3.1-Corin+BAY 11-7082组细胞活力显著升高（P＜0.05），凋亡率显著降低（P＜0.05）。

2.5 过表达Corin抑制NF-κB信号通路后增殖凋亡蛋白及通路蛋白表达两组细胞中ki67、p53、NF-κB 和IκBα的蛋白表达结果如图5和表5所示，与pcDNA3.1-Corin 组比较，pcDNA3.1-Corin+BAY 11-7082 组ki67和IκBα的表达均显著升高（P＜0.05），p53和NF-κB的表达均显著降低（P＜0.05）。

表3 过表达Corin对H2O2诱导的H9c2细胞增殖凋亡蛋白及NF-κB信号通路的影响

图3 过表达Corin对H2O2诱导的H9c2细胞增殖凋亡蛋白及NF-κB信号通路的影响（pcDNA3.1：pcDNA3.1载体；H2O2：过氧化氢；NF-κB：细胞核转录因子-κB；IκBα：NF-κB抑制蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶）

3 讨论

目前越来越多的研究显示氧自由基参与心脏重塑、心衰等心血管疾病的病理进程，但活性氧在这些疾病中的影响及调控作用还未明确[11,12]。大量研究显示，活性氧可由心肌细胞、中性粒细胞等的活化产生，机体过量的活性氧生成可引起组织细胞发生损伤，还可导致细胞内DNA断裂，染色体发生畸变，最终引起细胞死亡[13]。H2O2为活性氧的一种，目前大量研究采用H2O2作为模拟神经细胞、心肌细胞等发生氧化损伤的模型[14,15]。在本研究也使用H2O2建立心肌氧化应激模型。Corin是一种主要表达于心脏的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，通过将ANP活化而对心脏和血压功能进行调节，有研究显示，Corin基因发生变异和缺失可导致心力衰竭、心肌肥厚等多种心血管疾病发生发展[16,17]。如在高糖诱导的H9c2细胞中Corin的表达降低，抑制Corin的表达后心肌细胞增殖明显降低，且抑制了内皮细胞的损伤修复[18]。此外，流行病学的研究显示Corin浓度与心肌梗死、心衰等心血管疾病呈现出相关性[19]，这提示Corin在心血管疾病中的重要作用。但Corin基因对H2O2诱导的H9c2细胞增殖凋亡及机制研究的尚未清楚。

图4 过表达Corin通过NF-κB信号通路对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡的影响

表4 过表达Corin通过NF-κB信号通路对H2O2诱导的H9c2细胞活力及凋亡的影响

图5 过表达Corin抑制NF-κB信号通路后增殖凋亡蛋白及通路蛋白表达

鉴于前人研究的Corin基因的低表达可对心肌细胞造成损伤，本研究旨在过表达Corin对H2O2诱导的H9c2细胞的影响。将H2O2刺激及H2O2刺激和过表达Corin处理细胞，可发现H2O2刺激可降低细胞内Corin的表达，过表达Corin后Corin的表达明显升高。细胞活力及凋亡检测发现H2O2刺激可明显降低H9c2细胞活力，诱导细胞凋亡，而过表达Corin后细胞活力明显升高，凋亡率降低。这提示过表达Corin对心肌细胞损伤起保护作用。NF-κB是重要的一类核转录因子，是信号传导途径中的枢纽，参与肿瘤、免疫、炎症等的发生发展及调控细胞的增殖、凋亡等过程中基因的表达，其家族成员可与其抑制蛋白IκBs以同源或异源二聚体形式形成复合物，在细胞质中以非活性形式存在，在受到活化因素的刺激后IκBs发生磷酸化，从而引起NF-κB的激活[20-22]。目前多项研究表明NF-κB信号在多种心血管疾病中被激活，如心肌梗死、心室重构等，而抑制NF-κB信号通路可提高心肌细胞活力和降低细胞的凋亡[23,24]。Ki67是一种细胞增殖抗原，可以作为一个细胞增殖活性检测的重要指标，目前在包括心肌细胞等的研究中广泛应用[25]。p53是一个凋亡促进基因，研究显示，在心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死等心血管损伤疾病中p53表达升高，且可诱导心肌细胞的凋亡。本研究检测到H2O2刺激可明显上调p53和NF-κB表达，下调ki67和IκBα表达，过表达Corin后p53和NF-κB表达降低，ki67和IκBα表达升高，加入NF-κB信号通路抑制剂后对p53、NF-κB、ki67和IκBα表达影响更明显，且加入NF-κB信号通路抑制剂可明显提高心肌细胞活力和降低细胞凋亡。这提示H2O2刺激可激活NF-κB信号通路，通过下调ki67和上调p53对心肌细胞造成损伤，而过表达Corin可通过抑制NF-κB信号通路降低这一效应。

综上所述，过表达Corin可通过抑制NF-κB信号通路提高心肌细胞活力及降低细胞凋亡。对细胞活力及凋亡的影响方式是上调ki67表达和下调p53表达。该研究为Corin在心血管疾病中的作用研究奠定了一定的基础，可能为心血管疾病的分子靶向治疗提供了一定的理论基础。

表5 两组细胞中ki67、p53、NF-κB 和IκBα的蛋白相对表达量