血清ADMA、BNP、miRNAs 与先天性心脏病合并肺动脉高压关系的研究

黄勇，李蔚华，尹虹，饶红

在我国，先天性心脏病（CHD）作为发病率和死亡率最高的小儿心血管疾病之一，约占新生儿的8‰～10‰左右，其中50%以上患儿属于体-肺分流型心脏病，多伴有肺动脉高压（PAH）[1]。近些年，随着心外科手术技术的日臻成熟，CHD患儿手术成功率已经取得了长足进展，但是大多数CHD-PAH患儿生存率仍然较低，且手术危险性大大增加[2]。目前，右心导管监测血流动力学一直是临床上诊断PAH的“金标准”[3]，但是由于属于有创性检查，存在一定的应用局限，因此寻找敏感、快速、便捷的诊断指标是儿科领域一直积极探索的难题。近年来，大量研究证实miRNAs与肿瘤和心血管疾病密切相关，已经发现众多的miRNAs可作为多种疾病诊断、分级、预后的有效工具[4]。但是关于miRNAs与CHD合并PAH发生和发展的相关性研究尚少。另外，脑钠肽（BNP）和不对称二甲基精氨酸（ADMA）虽然作为敏感性和特异性较强的早期心肌损伤标志物已经得到临床普遍认可[5]，但是否可作为PAH可靠有效的诊断指标也尚待探讨。因此，笔者旨在通过本项研究探讨与CHD合并PAH可能相关的miRNAs，以及联合ADMA、BNP对于CHD患儿发生PAH的诊断价值。现研究报告如下：

1 资料与方法

1.1 研究对象本项研究选取2016年9月～2018年1月于华中科技大学同济医学院附属梨园医院儿科门诊的CHD患儿82例，男性患儿49例，女性患儿33例，年龄为3个月～14岁，平均年龄为（5.37±3.82）岁。所有患儿均表现为紫绀、活动后心悸，心前区可闻Ⅱ～Ⅳ级收缩期杂音。经心电图、超声心动图、X线胸片、常规检查以及生化检查确诊为CHD。其中27例患儿为单纯房间隔缺损（ASD），23例患儿为单纯室间隔缺损（VSD），19例患儿为房间隔缺损合并室间隔缺损，13例患儿为房动脉导管未闭（PDA）。根据右心导管检查肺动脉收缩压（sPAP）和肺动脉平均压（mPAP），将患儿分为CHD（n=29例）和CHD-PAH组（n=53例），本项研究获得当地伦理委员会批准。

1.2 患儿纳入和排除标准纳入标准：①所有患儿符合CHD的诊断标准；②年龄＜14岁；③无左室或右室流出道梗阻；④由患儿家属或其法定监护人签署知情同意书。排除标准：①不符合上述纳入标准的患儿；②合并肺血栓栓塞、慢性肺部疾病、肺血管病变、药源性PAH者；③合并严重心脏、肝脏、肾功能不全者；④合并免疫系统、血液系统疾病、严重出血倾向、急慢性感染者等。

1.3 研究方法

1.3.1 血液样本采集采集患儿外肘静脉血3 ml置于肝素钠真空采血管（美国BD公司）中，3000 rpm离心取上清，-20℃保存备用。

1.3.2 血液生化指标采用DXC800全自动生化分析仪（美国Beckman公司）检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）等。采用酶联免疫吸附测定试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）检测血清中BNP、ADMA水平。

1.3.3 肺动脉压力测定所有患儿经局麻后穿刺股静脉，置入6F血管鞘，将右心导管置入右室及肺动脉，记录压力曲线。

1.3.4 外周血miRNAs芯片分析取患儿外周静脉血5 ml，加入25 ml红细胞裂解液，冰浴30 min，混匀，3000 rpm离心5 min，收集白细胞，提取总RNA，测定浓度和纯度后，一部分进行miRNAs芯片分析，后续操作委托上海康成生物工程有限公司完成。另一部分置于-80℃保存备用。

1.3.5 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测外周血miRNAs ①提取总RNA。采用凝胶电泳检测RNA分子量；采用分光光度计检测RNA浓度。②RNA逆转录：根据Taqman® MicroRNA reverse transcription kit和Taqman® MicroRNA assay kit试剂盒（日本Takara公司）说明书操作进行。将cDNA保存至-20℃保存备用。③实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）：按照三步法进行PCR扩增。以组织cDNA为模板，以β-actin作为内参，将20 μl反应体系置于37℃恒温水浴60 min，85℃5 s，加入去离子水至100 μl，各反应孔取2 μl进行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反应体系，95℃30 s预变性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循环45次。根据NCBI数据库获得的资料设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。PCR结果判断：根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。

1.4 统计学分析将资料输入SPSS 17.0统计学软件进行处理分析，符合正态分布的计量资料以平均数±标准差（±s）表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用One-way ANOVA分析；计数资料以（%）表示，采用χ2检验；采用受试者工作特征（ROC）曲线确定各指标的诊断价值，采用Spearman等级相关性分析miRNAs、BNP、ADMA、mPAP之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿基本资料比较两组患儿的年龄、性别组成、血清ALT、AST、BUN、SCr水平以及CHD类型未见统计学差异（P＞0.05）；但是CHD+PAH患儿血清TC、TG水平、mPAP、血清BNP、ADMA水平均高于CHD组患儿（P＜0.05）（表1）。

2.2 两组患儿外周血miRNAs芯片分析结果各组芯片之间信号强度相关性分析：CHD组和CHD+PAH组相关系数为0.715。与CHD组相比，CHD+PAH组患儿外周血样本中有31例miRNAs表达显著下调，有32个miRNAs表达显著上调。其中，相较于CHD组患儿，ACHD+PAH组患儿外周血中hsa-miR-23a和hsa-miR-29c表达显著上调，hsa-miR-191和hsamiR-93显著下调（表2，图1）。

2.3 两组患儿外周血miRNAs含量比较经qRTPCR检测，与CHD组患儿相比，CHD+PAH组患儿外周血中miR-23a和miR-29c表达显著上调，而miR-191表达显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05），虽然miR-93表达也有所下调，但是与CHD组患儿外周血样本比较，未见统计学差异（P＞0.05）（表3）。

表1 两组患儿基本临床资料分析

表2 芯片分析中CHD组和CHD+PAH组表达存在明显差异的miRNAs

2.4 CHD+PAH组患儿外周血miRNAs的表达量与BNP、ADMA、mPAP的相关性经Spearman等级相关性分析，CHD+PAH组患儿外周血miR-23a与BNP、ADMA、mPAP呈正相关性（P＜0.05）；miR-191与BNP、ADMA、mPAP呈负相关性（P＜0.05）；miR-29c与ADMA和mPAP未见明显的相关性（P＞0.05）（表4）。

2.5 ROC曲线分析miR-23a、miR-191、ADMA、BNP对CHD合并PAH的诊断价值经ROC曲线分析，联合诊断的ROC曲线下的面积为0.923（95%CI：0.821～1.000），联合诊断价值明显高于血清ADMA（AUC=0.625，95%CI：0.414～0.798）、BNP（AUC=0.647，95%CI：0.515～0.794）、miR-23a（AUC=0.638，95%CI：0.516～0.804）、miR-191（AUC=0.576，95%CI：0.424～0.705）单独诊断价值。比较检测效能，差异有统计学意义（χ2=19.887，P＜0.05）（图2）。

图1 CHD组患儿和CHD+PAH组患儿层次聚类图

表3 两组患儿外周血中miRNAs表达水平比较（±s）

表3 两组患儿外周血中miRNAs表达水平比较（±s）

注：miRNAs：血清微小RNA；CHD：先天性心脏病；PAH：肺动脉高压

miRNAs CHD（n=29） CHD+PAH（n=53） t/χ2值 P值miR-23a 1.00±0.07 2.89±0.08 106.755 0.000 miR-29c 1.00±0.02 1.47±0.04 59.236 0.000 miR-191 1.00±0.03 0.54±0.04 54.103 0.000 miR-93 1.00±0.05 0.95±0.05 4.329 0.000

表4 外周血miRNAs与BNP、ADMA、mPAP的相关性分析

3 讨论

CHD是新生儿科和儿科常见的心血管系统疾病，是导致婴幼儿死亡的主要原因之一[6]。CHD患儿由于心脏结构异常，血液分流较多，易加重心脏负荷，进入肺循环的血流量增多，从而增加肺脏负担，形成PAH；肺部压力增大又可以进一步诱发肺小动脉反射性收缩，增加回心血量，加重心脏负荷，从而引发心力衰竭，交叉形成恶性循环[7]。因此CHD合并PAH患儿的死亡率较高，给患儿家庭增加了极大的经济负担和心理负担。CHD患儿合并肺动脉的发病机制极其复杂，与遗传、免疫、炎症反应等多种因素密切相关[8]，且发病初期缺乏典型的临床表现，因此寻找特异性诊断和疗效判断标志物，早诊断、早治疗一直是儿科医师急需解决的难题。

图2 CHD合并PAH患者血清ADMA、BNP、miR-23a、miR-191以及联合检测的ROC曲线图

目前临床上主要采取右心导管检测获得血流动力学数据以评估肺血管阻力，作为诊断CHD合并PAH的“金标准”，但是由于右心导管监测属于有创检查[9]，且婴幼儿本身属于耐受性较差的特殊群体，免疫系统和各器官功能尚未发育完善，易引发感染；而且大量研究和临床经验证实，当肺阻力升高至6woods以上时，手术风险大大增加，超过10woods时，一般即属于手术禁忌症[10]。而且当肺血管阻力升高至一定程度后，多进展为不可逆性病理改变，即使采取手术治疗，患儿预后也较差[11]。因此，越来越多的学者开始关注与PAH密切相关的体液因子的检测。miRNAs是真核生物基因中一类非编码的负性调控RNA，可以通过与靶基因3’-非编码区结合抑制RNA转录[12]。目前，关于miRNAs与肿瘤和心脑血管疾病之间的关系研究已经成为全球医学界的热点，但是国内外在关于miRNAs是否也参与了PAH的形成以及哪些靶基因可能作为CHD患者发生PAH诊断的候选标志物方面研究尚少。笔者通过基因芯片技术，筛选了表达差异性较大的四个目标miRNAs作为候选基因，又通过qRT-PCR技术进一步证实CHD组患儿和CHD+PAH组患儿外周血miR-23a、miR-29c、miR-191、miR-93表达的差异性，结果显示，与CHD组患儿相比，CHD+PAH组患儿外周血中miR-23a和miR-29c表达显著上调，而miR-191表达显著下调，这与基因芯片筛选结果基本一致。

随后，为了进一步证实miRNAs与CHD合并PAH的相关性，我们探讨了miR-23a、miR-29c、miR-191与BNP和ADMA的关系。BNP是临床上应用最为普遍的预测心力衰竭严重程度的最重要、最敏感的指标之一，具有降压、抑制交感神经活性、扩血管、改善内皮功能等作用。当心肌细胞受损时，BNP的合成迅速增加，与左室功能有良好的相关性，且不易受年龄、肾功能、外界因素得影响，可直接反应心功能状态[13]。而ADMA是近几年新发现的与CHD密切相关的抑制性细胞因子，通过与NOS活性部位结合抑制NO释放，从而促使PAH的发生和进展；而且大量研究已经证实其作为PAH的预测价值[14]。研究中发现，CHD+PAH组患儿外周血miR-23a和miR-191与BNP、ADMA、mPAP呈显著相关性。而且，miR-23a和miR-191联合BNP、ADMA对于CHD患儿发生PAH的预测价值远远高于单个指标的诊断价值。这也可以从分子机制方面作出解释。虽然关于miRNAs具体的作用机制尚未明确，但是早在本世纪初，就有研究证实miR-23a对于心肌肥大具有正性调节作用，并且与心力衰竭患者血清BNP呈显著正相关性，可作为评估心脏功能的敏感指标[15]；另外miR-23a也是低氧型肺血管重建的关键因子，与缺氧诱导的肺细胞凋亡、分泌等功能的变化密切相关[16]。目前临床上关于miR-191在心血管疾病领域的研究尚少，但是国外有研究证实急性心肌梗死患者外周血miR-191表达显著下调[17]，国内也有学者通过基因芯片技术也显示了PAH患者外周血miR-191表达呈下调趋势，但是通过RT-PCR检测未得到阳性结果[18]。

综上所述，CHD合并PAH作为一种诱因多样化且具有生物学异质性的危急重症，目前临床上仍以早诊断、早干预作为提高手术成功率、改善患者预后的前提，而miR-23a、miR-191有望成为CHD患者发生PAH的早期诊断标志分子，并且联合BNP和ADMA对于CHD合并PAH的诊断价值较高。但是由于PAH的发病机制复杂，相关的生物标志分子众多，而本项研究并未进行全面系统的研究，因此miR-23a、miR-191与CHD合并PAH的相关性以及可能的作用机制仍需要后续进一步研究证实。